GLRaV-Ⅲ RT-PCR檢測體系及櫻桃砧木莖尖培養(yǎng)技術的研究.pdf

1、果樹病毒病的致病特點是擴散性強，持久性和難以防治性，嚴重威脅著果樹的生長發(fā)育。本實驗第一部分通過對影響RT-PCR擴增因素進行研究，建立了葡萄卷葉病毒(GLRaV-Ⅲ)的RT-PCR檢測體系，并且對該體系進行優(yōu)化設計。在回收純化GLRaY-Ⅲ擴增的特異DNA片段的基礎上，對其進行了克隆測序研究。主要結果如下： 1.建立了GLRaV-Ⅲ的RT-PCR檢測體系，進一步優(yōu)化了該檢測體系，實現了高效低成本。結果表明，要獲得良好的RT-P

2、CR擴增，GLRaY-ⅢPCR體系中dNTPs濃度要為100μmol/L，TaqE的用量為1.0U，引物濃度在O.3～1.5μmol/L之間，MgCL2的濃度為0.9mmol/L。退火時間是60s，退火溫度在52℃～58℃之間，變性溫度達到94℃，變性時間是60s，延伸時間2min，循環(huán)25次。 2.以GLRav-Ⅲ的病毒RNA為模板，通過RT-PCR技術獲得了病毒特異擴增的部分CPgenecDNA片段，克隆到pUCmT。載體上

3、，構建了病毒部分CPgenecDNA的重組質粒。序列分析表明，它們的核苷酸序列與國外已發(fā)表的序列的堿基數完全相同，進一步佐證了RT-PCR檢測結果的可靠性。同源性達到了99.67％。 在果樹脫病毒的研究中，小莖尖結合熱處理法是目前常用的一種較有效的方法，小莖尖培養(yǎng)體系的建立，是病毒脫除的前提，也是脫毒苗快速繁殖的保證。本實驗第二部分以櫻桃砧木Colt的小莖尖為外殖體進行組織培養(yǎng)體系的建立，對繁殖各個階段的多種影響因素組合進行了系

4、統(tǒng)研究，初步建立了一套較為完整的櫻桃砧木Colt的小莖尖培養(yǎng)體系。在莖尖分化培養(yǎng)中，合適的培養(yǎng)基為1/2MS+1.Omg/LBA+0.1mg/LIBA。在增殖培養(yǎng)中，經過篩選得出，最佳培養(yǎng)基為1/2MS+1.Omg/LBA十O.2mg/LIBA+0.5mg/LGA3，增殖倍數高，植株生長勢旺，增殖階段最適的pH值為5.2～6.0。最適的蔗糖濃度是2～3％。生根培養(yǎng)階段，培養(yǎng)基1/2MS+0.5mg/LIBA上試管苗的生根效果最好，生根率