冷誘導(dǎo)金針菇原基形成的相關(guān)基因研究.pdf

1、金針菇(Flammulina velutipes)是一種低溫型食用菌，其原基的形成和子實(shí)體的發(fā)育需要經(jīng)過10~13℃的低溫刺激。冷誘導(dǎo)金針菇原基形成過程受到一些功能基因的調(diào)控，找到并研究這些相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)理具有重要的意義。組氨酸激酶基因和GATA Zinc finger轉(zhuǎn)錄因子在冷誘導(dǎo)金針菇原基形成過程中起著至關(guān)重要的作用。組氨酸激酶是雙組分系統(tǒng)的一種，當(dāng)植物受到低溫刺激時(shí)，自身能夠啟動(dòng)感受低溫信號和將信號傳導(dǎo)出去的信號通路，將外界的

2、低溫信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，并誘導(dǎo)相應(yīng)基因的表達(dá)。GATA Zinc finger是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，其普遍具有鋅指結(jié)構(gòu)，在植物的生長發(fā)育和冷誘導(dǎo)機(jī)制的信號傳導(dǎo)途徑中起著重要的調(diào)控作用。
　　CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近幾年發(fā)展起來的一種新型基因編輯技術(shù)，目前被廣泛的運(yùn)用到多種生物中進(jìn)行基因改造。CRISPR/Cas9系統(tǒng)只需要一個(gè)具有核酸酶功能的Cas9蛋白，和一個(gè)具有識別及定位功能的sgRNA就可以發(fā)揮基因編輯作用。本研究首先通

3、過生物信息學(xué)分析得到差異表達(dá)基因，構(gòu)建帶有目標(biāo)基因的CRISPR/Cas9表達(dá)系統(tǒng)，采用PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體的方法，首次將構(gòu)建的帶有組氨酸激酶基因和GATA轉(zhuǎn)錄因子的CRISPR/Cas9表達(dá)載體共轉(zhuǎn)入金針菇原生質(zhì)體，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯功能，對金針菇中的組氨酸激酶基因和轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行敲除，以此來驗(yàn)證這些基因的功能。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）通過轉(zhuǎn)錄組測序，得到了7935個(gè)差異表達(dá)基因，再通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)和生物

4、信息學(xué)分析，找到與冷誘導(dǎo)和生長發(fā)育相關(guān)的差異基因，在原基階段表達(dá)量下調(diào)的兩個(gè)組氨酸激酶基因HK1和HK2和一個(gè)GATAZinc finger轉(zhuǎn)錄因子。
　?。?）利用sgRNA在線設(shè)計(jì)工具以及sgRNA靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)原則，針對兩個(gè)組氨酸激酶基因和一個(gè)GATAZinc finger轉(zhuǎn)錄因子的基因序列，分別設(shè)計(jì)了一個(gè)sgRNA，靶序列分別為 GATGGACAGCGGAAAATTGG、GTACCTGTTCGAATGAATGA和GTGGCCA

5、AGCACTTGGAACA。
　?。?）采用酶切連接法和重疊延伸 PCR的方法，構(gòu)建了6個(gè)表達(dá)載體，分別是：pgfvs-Cas9、pHK1-gRNA、pHK2-gRNA、pZf-gRNA、pgfvs-Cas9-HK1-gRNA和pgfvs-Cas9-HK2-gRNA。
　?。?）通過金針菇原生質(zhì)體單核化，得到了3個(gè)單核菌株：D-A、D-C和D-D，通過對單核菌株出菇實(shí)驗(yàn)，得到單核菌株均能出菇，最終確定了轉(zhuǎn)化所需的單核菌株為：