骨髓間充質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合維生素K2對大鼠肝癌HepG2細(xì)胞抑制作用及其機(jī)制的實驗研究.pdf

1、目的:研究骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(MSCs),與維生素K2(Vit K2)單獨及聯(lián)合應(yīng)用對肝癌HepG2細(xì)胞系的作用及其機(jī)制,為MSCs和VitK2應(yīng)用于肝癌治療的可能性提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.體外通過全骨髓培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增大鼠MSCs,倒置顯微鏡下觀察記錄細(xì)胞形態(tài)及生長特征,采用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志CD29、CD34、CD45、CD90的表達(dá),確認(rèn)其分子表型。
　　 2.

2、體外培養(yǎng)大鼠肝癌HepG2細(xì)胞系,使其處于對數(shù)生長期,并予以擴(kuò)增達(dá)到實驗數(shù)目。實驗分四組:A組:單純加MSCs,終濃度為0.5×105/ml、1×105/ml、2×105/ml3個濃度;B組:單純加VitK2,終濃度為10μmol/ml、20μmol/ml、40μmol/ml3個濃度;C組:A組與B組分別組合,組合后形成低中高三個聯(lián)合濃度;D組:陰性對照組,只有肝癌HepG2細(xì)胞,未加任何試劑,細(xì)胞定期給予換液。每組不同濃度分別設(shè)4個復(fù)

3、孔,每孔終體積150μl,于37℃、5％濃度CO2下培養(yǎng);培養(yǎng)液每24h更換一次。倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,甲基噻唑基四唑(MTT)比色法測定各組細(xì)胞的生長抑制率,FCM檢測各組細(xì)胞凋亡率,并分析細(xì)胞周期變化,RT-PCR檢測各組細(xì)胞中NF-κBmRNA表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.倒置顯微鏡觀察記錄細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn),MSCs隨著培養(yǎng)天數(shù)變化呈現(xiàn)橢圓形、梭狀或多邊形等不同形態(tài),增殖迅速;消化傳代的細(xì)胞增殖更加迅

4、速,呈典型的MSCs形態(tài),為均一的長梭形,融合后呈漩渦狀或紡錘狀。
　　 2.采用FCM對第三代MSCs進(jìn)行表型鑒定,發(fā)現(xiàn)高表達(dá)CD29、CD90,低表達(dá)CD34、CD45。
　　 3.倒置顯微鏡下觀察:陰性對照組肝癌HepG2細(xì)胞大小形態(tài)不一致,隨著時間延長能疊加成堆生長,喪失接觸抑制和密度抑制;但實驗組細(xì)胞呈圓形,核漿比例減少,呈單層生長,在長至匯合后呈現(xiàn)接觸抑制和密度抑制,細(xì)胞數(shù)量隨著時間和藥物濃度的增加而下降,聯(lián)

5、合處理組效果更明顯,細(xì)胞稀少。
　　 4.MTT比色法顯示不同濃度的MSCs(0.5×105/ml、1×105/ml、2×105/ml)和VitK2(10μmol/ml、20μmol/ml、40μmol/ml)均能抑制肝癌HepG2細(xì)胞的生長。隨著MSCs和VitK2濃度的增加,抑制作用逐漸增強(qiáng),呈現(xiàn)明顯的劑量-時間效應(yīng)。同一作用時間不同藥物濃度組間的細(xì)胞生長抑制率差異有顯著性意義;同一濃度組不同作用時間之間的細(xì)胞生長抑制率差異

6、亦有顯著性意義;聯(lián)合用藥組比單獨用藥組具有更高的抑制率,其差異亦有顯著性意義。
　　 5.FCM檢測大鼠肝癌HepG2細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示,隨著MSCs和(或)VitK2濃度的增加和作用時間的延長,細(xì)胞凋亡率逐漸升高,亦呈現(xiàn)明顯的劑量-時間效應(yīng)。相同藥物各單用組間比較差異有顯著性意義。聯(lián)合用藥組比單獨用藥組具有更高的凋亡率,其差異亦有顯著性意義。
　　 6.FCM檢測MSCs和(或)VitK2對肝癌HepG2細(xì)胞周期影響結(jié)

7、果顯示:各實驗組細(xì)胞周期變化基本相同,均表現(xiàn)為G0/G1期細(xì)胞減少,S期細(xì)胞增多,G2/M期細(xì)胞無明顯變化,聯(lián)合用藥組更明顯,與單用實驗組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。各組中細(xì)胞周期隨著濃度的增加和時間的延長而作用更明顯。
　　 7.各組細(xì)胞培養(yǎng)72h后應(yīng)用RT-PCR.檢測細(xì)胞NF-κmRNA的表達(dá),發(fā)現(xiàn)對照組表達(dá)較高,實驗組隨著MSCs和(或)VitK2濃度的升高,細(xì)胞NF-κB mRNA的表達(dá)量逐漸降低。單用組細(xì)胞NF-κB m