中藥單體蟾毒靈對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、一、研究背景:肝癌是世界第五大癌癥,每年有上百萬(wàn)人死于肝癌,世界范圍內(nèi)每年的新發(fā)病例數(shù)約為550000,占人類癌癥的5％,占癌癥死亡率的第三位。目前對(duì)肝癌的主要治療方法是進(jìn)行手術(shù)治療(切除或移植),但大多數(shù)肝癌病人發(fā)現(xiàn)已屬晚期,并不符合手術(shù)治療條件,并且手術(shù)治療后面臨術(shù)后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的問(wèn)題。我國(guó)是肝癌高發(fā)地區(qū),中藥用于治療腫瘤的歷史悠久,并已取得顯著的效果,中藥單體的分離以及藥理作用研究是目前研究中藥的一個(gè)重要途徑.蟾毒靈(bufalin

2、)是從中藥蟾酥中提取的一種毒性配基之一,分子式為C24H32O4,相對(duì)分子質(zhì)量為386.5,已有研究表明蟾毒靈是一種Na+-K+-ATPP酶抑制劑,屬蟾酥二烯羥酸內(nèi)酯單體之一,因其結(jié)構(gòu)與洋地黃類似,也被歸為強(qiáng)心類固醇類。文獻(xiàn)報(bào)道能夠抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的活性,干擾細(xì)胞DNA復(fù)制,早期多數(shù)研究集中在對(duì)誘導(dǎo)人類白血病分化和凋亡方面,近年來(lái)有研究表明蟾毒靈可以抑制子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞以及卵巢癌、前列腺癌等的生長(zhǎng),促進(jìn)細(xì)胞凋亡。源于華蟾素藥物在本科室臨

3、床治療肝癌的有效應(yīng)用以及前期的相關(guān)工作基礎(chǔ)提示蟾毒靈單體能夠抑制人肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng),本課題選用國(guó)內(nèi)外研究人肝癌細(xì)胞應(yīng)用較為廣泛的細(xì)胞株HepG2,研究了蟾毒靈單體對(duì)人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用并探討了其部分相關(guān)機(jī)制。 二、研究目的: 1.體外觀察蟾毒靈抑制肝癌細(xì)胞株HepG2生長(zhǎng)的作用,明確量效關(guān)系,選擇一個(gè)最小有效劑量和時(shí)間為后期機(jī)制研究作參考。 2.明確蟾毒靈對(duì)細(xì)胞周期分布的影響,在細(xì)胞周期改變的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究

4、蟾毒靈對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白以及周期蛋白依賴性激酶的改變情況。 3.明確蟾毒靈對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用,并且明確蟾毒靈對(duì)凋亡相關(guān)蛋白bc1-2及bax的影響以及在其誘導(dǎo)凋亡的同時(shí)有哪些主要信號(hào)通路發(fā)生了變化。 4.為臨床應(yīng)用蟾毒靈治療HCC提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 三、研究方法: 1.MTT法測(cè)定不同濃度(0.128、0.64、3.2、16、80、400、2000、10000nM)的蟾毒靈單體作用不同時(shí)間(24h、4

5、8h、72h)對(duì)肝癌細(xì)胞細(xì)胞株HepG2的生長(zhǎng)抑制作用。 2.流式細(xì)胞儀(FCM)采用PI染色及Rnase消化方法檢測(cè)不同濃度蟾毒靈分別作用-24h及48h對(duì)HepG2細(xì)胞周期分布的影響；進(jìn)一步選擇周期阻滯最明顯的劑量80nM蟾毒靈,觀察其在24h內(nèi)作用不同時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞周期分布的影響；并且初步根據(jù)細(xì)胞周期亞二倍體峰或稱亞G1峰來(lái)判斷蟾毒靈對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)情況。 3.采用AnnexinV/PI凋亡試劑盒通過(guò)FCM分

6、析檢測(cè)蟾毒靈誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況。選擇80nM、400nM、2μM濃度作用不同時(shí)間(24、48、72小時(shí)),觀察是否具有濃度以及時(shí)間依賴性。 4.基于對(duì)細(xì)胞周期阻滯以及凋亡誘導(dǎo)的確定性判斷,采用Western blot方法檢測(cè)蟾毒靈作用后細(xì)胞周期相關(guān)蛋白以及激酶的改變,檢測(cè)主要促凋亡以及抑制凋亡的蛋白以及信號(hào)通路的改變情況。 5.RT-PCR檢測(cè)蟾毒靈對(duì)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2及Bax的mRNA水平的影響。 四、研究結(jié)果:

7、 1.MTT結(jié)果顯示,蟾毒靈對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性。其24h、48h和72h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為102±5.231nM、83±3.142nM和67±3.356nM。 2.蟾毒靈作用于HepG2,在80nM濃度內(nèi)隨濃度增加G2/M期比例明顯增加,其他兩期比例減少,作用到24h G2/M期比例增加至68％,濃度或時(shí)間繼續(xù)增加G2/M比例逐漸減少,凋亡比例開始增加；G2/M作用24h

8、內(nèi)隨時(shí)間增加G2/M比例逐漸增加,撤銷藥物后細(xì)胞周期阻滯情況不可逆。 3.蟾毒靈在400HM以上濃度能夠顯著誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡,隨時(shí)間及劑量的增加凋亡細(xì)胞比例逐漸增加,呈時(shí)間劑量依賴性(24h、48h、72h),撤銷藥物后凋亡不可逆。 4.Western blot檢測(cè)顯示804濃度蟾毒靈作用6h G2/M期調(diào)控蛋白cyelinB1開始下降,24h內(nèi)隨時(shí)間增加逐漸下調(diào),對(duì)CDK1沒(méi)有明顯的改變：400nm蟾毒靈作用后

9、隨時(shí)間增加能夠下調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2 mRNA水平及其蛋白的表達(dá),同時(shí)上調(diào)促凋亡蛋白Bax mRNA水平及其蛋白的表達(dá)；400nm蟾毒靈作用3h后隨時(shí)間增加AKT信號(hào)通路的活化受到抑制、JNK姒PK信號(hào)通路的活化增加。 五、研究結(jié)論: 1.蟾毒靈單體能夠抑制HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng),且抑制作用呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性。 2.蟾毒靈單體能夠下調(diào)cyclinBl的表達(dá),使其不能與CDK1形成有效的MPF復(fù)合物,從而使