三維培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞對肝癌細胞增殖的抑制作用及其機制的研究.pdf

1、目的:間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有多向分化和靶向腫瘤細胞潛能的成體干細胞，并能夠在體內(nèi)外分泌細胞因子，調(diào)節(jié)腫瘤細胞的凋亡、周期和轉(zhuǎn)移等相關(guān)信號通路，進而能夠?qū)δ[瘤起到抑制作用。目前，體外MSCs的研究多在二維培養(yǎng)條件下完成。二維細胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)的細胞在體外環(huán)境下逐漸喪失了其體內(nèi)原有的性狀，在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能方面都與其在體內(nèi)自然生長的狀態(tài)有一定的差距;而動物實驗具有多種不可控因素，探究具

2、體機制方面存在諸多困難。三維細胞培養(yǎng)技術(shù)是在二維細胞培養(yǎng)和動物實驗?zāi)Ｐ偷幕A(chǔ)上發(fā)展起來的簡單、有效的細胞培養(yǎng)方式，利用三維細胞培養(yǎng)技術(shù)可以更好的模擬體內(nèi)微環(huán)境，從而能夠更好的研究MSCs對腫瘤的抑制作用。鑒于此，本論文旨在建立人骨髓MSCs的高效三維培養(yǎng)體系，并研究其在三維與二維體系中的活性、增殖和細胞因子分泌情況，在此基礎(chǔ)上進一步探討MSCs在三維和二維培養(yǎng)條件下對肝癌細胞的抑制作用和機制，為三維培養(yǎng)的MSCs應(yīng)用于腫瘤治療提供實驗依

3、據(jù)，拓展了干細胞的應(yīng)用前景。
　　方法:首先，采用天然高分子材料膠原和Matrigel為支架建立三維培養(yǎng)體系培養(yǎng)MSCs，利用AO/PI染色法、CCK-8法和透射電鏡分析研究了三維體系培養(yǎng)的MSCs與二維單層培養(yǎng)體系培養(yǎng)的MSCs在活力、增殖和因子分泌方面的不同。其次，利用條件培養(yǎng)基(conditioned medium，CM)實驗研究了三維培養(yǎng)的MSCs通過分泌細胞因子對肝癌細胞HepG2產(chǎn)生的體外抑制作用。同時，進行裸鼠體內(nèi)異

4、位瘤實驗，裸鼠皮下分別注射經(jīng)過三維和二維培養(yǎng)的MSCs的CM處理過的HepG2細胞，觀察腫瘤形成起始時間，測量腫瘤體積，并進行冰凍切片和蘇木精-伊紅組織切片染色(hematoxylin-eosin staining，H&E)，探討了MSCs在體內(nèi)對肝癌細胞HepG2的抑制作用。然后對三維和二維培養(yǎng)的MSCs進行基因表達芯片的檢測，探究不同的培養(yǎng)體系對MSCs基因表達的影響。在此基礎(chǔ)上結(jié)合查閱文獻結(jié)果，篩選出三維培養(yǎng)的MSC表達上調(diào)最明顯

5、的抑癌因子IL-24作為候選因子，來進一步探究其在MSCs抑制HepG2增殖過程中的作用。接著利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)、實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)和酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)驗證三維培養(yǎng)的MSCs表達和分泌I

6、L-24因子的情況。隨后，RT-PCR檢測HepG2細胞中IL-24因子的受體IL-20R1、IL-20R2和IL-22R1的表達。最后，Western Blot檢測了三維和二維培養(yǎng)體系培養(yǎng)的MSCs CM處理過的HepG2細胞中JAK-STAT信號通路相關(guān)蛋白的表達，探究MSCs對HepG2細胞的抑制機制。
　　結(jié)果:AO/PI染色法實驗結(jié)果證明，三維和二維體系培養(yǎng)的MSCs活率均較好，而且三維體系培養(yǎng)的MSCs活率比二維體系培

7、養(yǎng)組更好，細胞成疊層生長，活細胞數(shù)量更多。CCK-8實驗結(jié)果表明，接種相同數(shù)量的MSCs在三維和二維培養(yǎng)體系中培養(yǎng)，從第4d開始，兩組的增殖情況表現(xiàn)出極顯著的差異（***p＜0.001）。培養(yǎng)后的第11d，三維培養(yǎng)的MSCs的OD值是二維培養(yǎng)組的3倍。由此可見，三維培養(yǎng)的MSCs具有更好的增殖能力。透射電鏡觀察結(jié)果表明，三維培養(yǎng)的MSCs相比于二維培養(yǎng)組含有更少的微絨毛和更多的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，說明細胞在膠原/Matrigel支架材料中生長良

8、好，更接近體內(nèi)的生長狀態(tài)，合成蛋白質(zhì)的能力更強。隨后的CM實驗結(jié)果證明，三維和二維培養(yǎng)的MSCs可以通過分泌細胞因子對HepG2細胞產(chǎn)生抑制作用，且三維培養(yǎng)組抑制作用更強。實驗結(jié)果也證明了，三維和二維培養(yǎng)的MSCs的抑制效應(yīng)存在劑量依賴性和時間依賴性，即隨著MSCs CM濃度的增加和處理時間的延長，抑制率增加。體內(nèi)實驗證明，三維和二維培養(yǎng)的MSCs均能延遲腫瘤的起始時間，分別延遲了12d和8d;而且腫瘤的大小也被抑制，結(jié)果顯示，三維處理

9、組腫瘤體積最小，二維處理組次之，對照組腫瘤體積最大，而且三個組腫瘤體積大小差異極顯著(***p＜0.001)。腫瘤組織的H&E染色結(jié)果證明，未處理的HepG2對照組中可以看見豐富密集的腫瘤細胞，且瘤細胞較大，染色較深，二維培養(yǎng)的MSCs CM處理組中腫瘤細胞分布較少，結(jié)締組織較多，三維培養(yǎng)的MSCs CM處理組中腫瘤細胞分布最少，結(jié)締組織最多。
　　Affymetrix GeneChip(@)PrimeViewTM Human G

10、ene Expression Array檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三維和二維培養(yǎng)的MSCs表達差異最明顯的是IL-24因子，隨后通過RT-PCR、Real-time PCR和ELISA實驗進一步驗證了這一結(jié)果，證明了三維培養(yǎng)的MSCs較二維培養(yǎng)組和對照組表達和分泌更多的IL-24因子。HepG2細胞的RT-PCR結(jié)果顯示，HepG2細胞中IL-24因子的受體IL-22R1和IL-20R2表達量較高，而IL-20R1幾乎不表達，由此推測IL24因子可

11、能通過IL-22R1/IL-20R2異源二聚體將信號傳遞到HepG2細胞中。Western Blot實驗結(jié)果證明，三維培養(yǎng)的MSCs CM處理組中磷酸化的JAK1和STAT3較其它組表達上調(diào)，且這兩種磷酸化蛋白的表達量和其它組相比差異極顯著（***p＜0.001）。
　　結(jié)論:本研究建立了膠原/Matrigel三維支架材料構(gòu)成的MSCs三維培養(yǎng)體系，證明了，該三維體系培養(yǎng)的MSCs在細胞活力、細胞增殖、基因表達等方面都具有很好的效

12、果。體內(nèi)外實驗證明了三維體系培養(yǎng)的MSCs比二維體系培養(yǎng)的MSCs對肝癌細胞有更強的抑制作用，并進一步探討了其抑制作用增強的機制。三維培養(yǎng)的MSCs能夠表達和分泌更多的IL-24因子，IL-24能與HepG2細胞表面受體IL-22R1/IL-20R2異源二聚體結(jié)合，并激活下游JAK1-STAT3信號通路，從而抑制了HepG2細胞的增殖，在三維培養(yǎng)的MSCs對HepG2細胞的抑制效應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。本實驗突破了傳統(tǒng)的對二維單層培養(yǎng)的MS