凋亡素修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的體外抑制作用研究.pdf

1、目的:肝癌是全球癌癥第三號(hào)殺手，術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率很高，這成為肝癌臨床治療的難題。干細(xì)胞治療是目前正在探索的腫瘤新型生物治療方法之一。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)由于能夠向腫瘤遷移、免疫原性低等特性有望成為抗腫瘤因子靶向治療的理想載體;凋亡素具有對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒性的廣譜抗腫瘤特性;腺病毒載體具有毒性低、轉(zhuǎn)基因持續(xù)表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)。但目前將MSCs、腺病毒及凋亡素聯(lián)合應(yīng)用于肝癌抑制作用的研究尚未見報(bào)道。本論文

2、構(gòu)建表達(dá)凋亡素的腺病毒并感染人骨髓MSCs，通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，探索MSCs向肝癌細(xì)胞的遷移及其腺病毒載體介導(dǎo)的凋亡素修飾的MSCs對(duì)肝癌細(xì)胞的體外抑制作用。本研究的開展探討了癌癥的干細(xì)胞療法，為癌癥的臨床治療提供新的途徑與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)為干細(xì)胞為載體的新型體內(nèi)給藥系統(tǒng)的研究奠定基礎(chǔ)，有望解決腺病毒載體直接遞送藥物引起的免疫排斥問題。
　　方法:首先，利用transwell進(jìn)行MSCs與HepG2共培養(yǎng)，檢測(cè)MSCs向肝癌細(xì)胞HepG

3、2的遷移能力。其次，根據(jù)GeneBank上登錄的凋亡素Apoptin(vp3)基因序列，全基因合成vp3，經(jīng)過(guò)修飾后獲得凋亡素的編碼基因?yàn)?66bp;將vp3基因插入穿梭載體pAd-Track-CMV（含有GFP基因），獲得穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-vp3;利用PmeⅠ線性化上述鑒定成功的質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的RecA+E.coli BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建pAd-vp3重組質(zhì)粒，并通過(guò)限制性內(nèi)切

4、酶方法鑒定分析;PacⅠ消化pAd-vp3去除抗性基因及原核復(fù)制元件，獲得重組腺病毒Ad-vp3;隨后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞并擴(kuò)增，獲得高滴度的病毒顆粒。利用此高滴度的病毒顆粒感染MSCs，收集病毒顆粒感染后的MSCs培養(yǎng)上清，利用Western Blot檢測(cè)凋亡素的表達(dá)，從而獲得表達(dá)凋亡素蛋白的MSCs;收集穩(wěn)定表達(dá)凋亡素的MSCs的條件培養(yǎng)基作用于HepG2，同時(shí)將穩(wěn)定表達(dá)凋亡素的MSCs和HepG2共培養(yǎng)，檢測(cè)對(duì)HepG2的抑制作用。

5、r>　　結(jié)果:通過(guò)遷移實(shí)驗(yàn)證明，MSCs具有明顯向肝癌細(xì)胞HepG2遷移的能力(P＜0.01);成功構(gòu)建了可表達(dá)凋亡素Apoptin的重組腺病毒Ad-vp3，感染293細(xì)胞，獲得了高滴度（1.0×1012 pfu/mL）的病毒顆粒，提取病毒基因組，檢測(cè)到凋亡素基因的存在，證明符合構(gòu)建目的;高滴度的病毒顆粒感染MSCs后，利用Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)感染后的MSCs培養(yǎng)上清中有凋亡素的表達(dá)，從而獲得表達(dá)凋亡素蛋白的MSCs;體外抑

6、制實(shí)驗(yàn)表明，穩(wěn)定表達(dá)凋亡素的MSCs和HepG2共培養(yǎng)后，表達(dá)凋亡素的MSCs可以顯著抑制HepG2的增殖(P＜0.01)。同時(shí)，穩(wěn)定表達(dá)凋亡素的MSCs的條件培養(yǎng)基也可以明顯抑制HepG2的增殖(P＜0.05)，但對(duì)正常細(xì)胞沒有抑制作用。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功地利用腺病毒系統(tǒng)構(gòu)建了重組腺病毒Ad-vp3，感染MSCs獲得了表達(dá)凋亡素的MSCs，并證明經(jīng)凋亡素修飾的MSCs及其條件培養(yǎng)基均可以明顯抑制HepG2的增殖，為探討癌癥的