黃連素對(duì)肝癌HepG-,2-細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)及生長(zhǎng)抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的；了解p53蛋白、cyclinD1和Caspase-3在人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞上表達(dá)和定位；觀察黃連素對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)及對(duì)其p53蛋白、cyclinD1和Caspase-3表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探討黃連素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。 方法；利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)制作細(xì)胞爬片，以免疫組織化學(xué)SABC法檢測(cè)了p53蛋白、cyclinD1和Caspase-3在人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞上表達(dá)和定

2、位。將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)體系分為黃連素組、陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。黃連素組以不同濃度的黃連素處理；陽(yáng)性對(duì)照組用不同濃度5-Fu處理；陰性對(duì)照組以細(xì)胞培養(yǎng)基+PBS處理。四甲基偶氮唑蘭(MTT)比色法用以判斷細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率；免疫組織化學(xué)法用以測(cè)定p53、cyclinD1和Caspase-3的表達(dá)豐度；流式細(xì)胞術(shù)(FCM)及瓊脂糖凝膠電泳法用以分析黃連素對(duì)HepG2的細(xì)胞周期及凋亡的影響。采用上述同樣方法，研究黃連素對(duì)人正常肝細(xì)胞Chan

3、gLiver的生長(zhǎng)抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。 結(jié)果：(1)在人肝癌細(xì)胞株HepG2上，p53蛋白有較強(qiáng)的表達(dá)，主要分布于細(xì)胞核；CyclinD1表達(dá)豐度較強(qiáng)，主要分布于細(xì)胞核；Caspase-3的表達(dá)較少。(2)以空白對(duì)照組的生長(zhǎng)抑制率為0，黃連素作用濃度為1.0μmol/L時(shí)，HepG2細(xì)胞在12、24、48、72h的生長(zhǎng)抑制率(IR)分別為5.7％、8.8％、14.5％、19.6％；黃連素作用濃度為10μmol/L，HepG2細(xì)胞

4、于12、24、48、72h的IR分別為9.6％、13.7％、19.2％、29.3％；黃連素作用濃度為10μmol/L時(shí)，HepG2細(xì)胞于12、24、48、72h的IR分別為14.3％、20.2％、29.6％、39.2％；與陰性對(duì)照組相比，各濃度組的各時(shí)間點(diǎn)的IR均有具有顯著性升高，且呈時(shí)間-劑量依賴關(guān)系。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，上述濃度黃連素對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用則無(wú)顯著性差異。(3)免疫組織化學(xué)分析顯示，經(jīng)黃連素、5-Fu處理的He

5、pG2細(xì)胞，其突變型p53、CyclinD1表達(dá)水平較陰性對(duì)照組顯著降低，而Caspase-3的表達(dá)明顯增強(qiáng)，黃連素與5-Fu作用的兩組間則無(wú)顯著性差異。(4)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)表明，黃連素能使HepG2細(xì)胞G0/G1期比例明顯增加，S期和G2期HepG2細(xì)胞比例明顯下降，即細(xì)胞被阻滯在G0/G1期；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率為36.9％，與陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率(6.3％)相比明顯下降(P＜0.01)。瓊脂糖凝膠電泳顯示，實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組在作用7

6、2h時(shí)有明顯的ladder凋亡帶，而陰性對(duì)照組則未顯示凋亡帶。 結(jié)論：(1)在人肝癌細(xì)胞株HepG2上，p53蛋白和cyclinD1在細(xì)胞核上呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；而Caspase-3呈弱陽(yáng)性表達(dá)。(2)一定濃度的黃連素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞有顯著的生長(zhǎng)抑制作用；黃連素可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡；黃連素可使HepG2細(xì)胞阻抑于G0/G1期。(3)Caspase-3和CyclinD1在黃連素誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻抑的過(guò)程中發(fā)