黃連素對肝癌HepG-,2-細胞凋亡誘導(dǎo)及生長抑制作用的實驗研究.pdf

1、目的；了解p53蛋白、cyclinD1和Caspase-3在人肝癌細胞株HepG2細胞上表達和定位；觀察黃連素對人肝癌細胞株HepG2細胞的凋亡誘導(dǎo)及對其p53蛋白、cyclinD1和Caspase-3表達的影響，以進一步探討黃連素誘導(dǎo)人肝癌細胞株HepG2細胞凋亡的可能機制。 方法；利用細胞培養(yǎng)技術(shù)制作細胞爬片，以免疫組織化學(xué)SABC法檢測了p53蛋白、cyclinD1和Caspase-3在人肝癌細胞株HepG2細胞上表達和定

2、位。將HepG2細胞培養(yǎng)體系分為黃連素組、陽性對照組和陰性對照組。黃連素組以不同濃度的黃連素處理；陽性對照組用不同濃度5-Fu處理；陰性對照組以細胞培養(yǎng)基+PBS處理。四甲基偶氮唑蘭(MTT)比色法用以判斷細胞的生長抑制率；免疫組織化學(xué)法用以測定p53、cyclinD1和Caspase-3的表達豐度；流式細胞術(shù)(FCM)及瓊脂糖凝膠電泳法用以分析黃連素對HepG2的細胞周期及凋亡的影響。采用上述同樣方法，研究黃連素對人正常肝細胞Chan

3、gLiver的生長抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。 結(jié)果：(1)在人肝癌細胞株HepG2上，p53蛋白有較強的表達，主要分布于細胞核；CyclinD1表達豐度較強，主要分布于細胞核；Caspase-3的表達較少。(2)以空白對照組的生長抑制率為0，黃連素作用濃度為1.0μmol/L時，HepG2細胞在12、24、48、72h的生長抑制率(IR)分別為5.7％、8.8％、14.5％、19.6％；黃連素作用濃度為10μmol/L，HepG2細胞

4、于12、24、48、72h的IR分別為9.6％、13.7％、19.2％、29.3％；黃連素作用濃度為10μmol/L時，HepG2細胞于12、24、48、72h的IR分別為14.3％、20.2％、29.6％、39.2％；與陰性對照組相比，各濃度組的各時間點的IR均有具有顯著性升高，且呈時間-劑量依賴關(guān)系。與陽性對照組相比，上述濃度黃連素對HepG2細胞的生長抑制作用則無顯著性差異。(3)免疫組織化學(xué)分析顯示，經(jīng)黃連素、5-Fu處理的He

5、pG2細胞，其突變型p53、CyclinD1表達水平較陰性對照組顯著降低，而Caspase-3的表達明顯增強，黃連素與5-Fu作用的兩組間則無顯著性差異。(4)流式細胞技術(shù)檢測表明，黃連素能使HepG2細胞G0/G1期比例明顯增加，S期和G2期HepG2細胞比例明顯下降，即細胞被阻滯在G0/G1期；實驗組細胞凋亡率為36.9％，與陰性對照組細胞凋亡率(6.3％)相比明顯下降(P＜0.01)。瓊脂糖凝膠電泳顯示，實驗組和陽性對照組在作用7

6、2h時有明顯的ladder凋亡帶，而陰性對照組則未顯示凋亡帶。 結(jié)論：(1)在人肝癌細胞株HepG2上，p53蛋白和cyclinD1在細胞核上呈強陽性表達；而Caspase-3呈弱陽性表達。(2)一定濃度的黃連素對人肝癌HepG2細胞有顯著的生長抑制作用；黃連素可誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡；黃連素可使HepG2細胞阻抑于G0/G1期。(3)Caspase-3和CyclinD1在黃連素誘導(dǎo)肝癌HepG2細胞凋亡和細胞周期阻抑的過程中發(fā)