小鼠卵巢中生殖干細胞的分離培養(yǎng)與鑒定.pdf

1、研究背景：
　　性腺作為傳遞遺傳物質的唯一組織,在睪丸中已經(jīng)證實有生殖系干細胞,即精原干細胞(spermatogonial stem cells,SSCs)的存在,并成功進行了體外培養(yǎng),通過生精過程產生精子。但是,在卵巢中,雌性生殖干細胞的存在(female germline stem cells,FGSCs)仍然有爭議。
　　傳統(tǒng)的觀點認為:卵母細胞的數(shù)量在出生后的數(shù)量是固定存在的,雌性哺乳動物卵泡池中不存在一種能增殖的生

2、殖細胞。這一觀點持續(xù)了半個多世紀,然而,在2004年Johnson等經(jīng)過測定小鼠不同天數(shù)未閉鎖卵泡數(shù)和閉鎖卵泡數(shù),發(fā)現(xiàn)卵泡閉鎖的發(fā)生率要高于卵泡數(shù)量的減少率,因此推測卵巢組織內存在有增殖活性的生殖細胞,這一觀點打破了傳統(tǒng)觀的生殖細胞的理論。在其后,不同的學者紛紛利用不同的方法進行反復的驗證,其中最有意義的是Zou等通過MVH標記進行磁珠分選,獲得的生殖細胞進行體外培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)其具有增殖的潛能,轉染GFP標簽后原位移植生殖細胞毀損鼠,與雄性

3、交配后產下正常的轉基因GFP小鼠。White等成功通過流式細胞(FACS)分選小鼠和人類的GSCs,又通過GFP標記GSCs,移植至小鼠卵巢內,獲得GFP陽性的卵母細胞。然而有些學者仍然堅持著傳統(tǒng)的觀點,ZhangH等通過內源性的基因的方法和多種熒光Rosa26,Ddx4-Cre體外追蹤生殖干細胞的方法,結果未發(fā)現(xiàn)表達Ddx4有增殖活性的生殖細胞。
　　因此,卵巢組織內是否存在FGSCs,仍然存在著巨大的爭議。本研究試圖通過定位小

4、鼠卵巢內增殖的生殖細胞,再聯(lián)合膠原酶和胰酶消化卵巢及利用差異貼壁法進行細胞的分離純化,采用與SSCs相似的培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)細胞,并利用卵泡液的性質尋找FGSCs的分化能力,并鑒定其生物學特性。
　　目的：
　　分離、培養(yǎng)、鑒定卵巢中的雌性生殖干細胞,并進一步探討其分化能力,為生殖干細胞的存在提供證據(jù)。
　　方法：
　　1)利用Brdu和MVH雙標免疫熒光定位體內具有增殖活性的生殖細胞;
　　2)取2～5d新

5、生鼠卵巢組織,膠原酶、胰蛋白酶聯(lián)合消化獲得單個細胞懸液,取12.5d孕鼠的胎鼠獲得胚胎成纖維細胞(MEF),以5×104個/mL,接種于24孔培養(yǎng)板,做為飼養(yǎng)細胞,添加不同生長因子的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,觀察細胞的形態(tài);
　　3)免疫熒光及組化檢測培養(yǎng)細胞的干細胞標記物Oct4、SSEA-1,生殖細胞標記物MVH,Brdu-MVH雙標的表達;
　　4)向處于減數(shù)分裂時的細胞中添加人卵泡液,觀察細胞的分化形態(tài);并鑒定其分化

6、功能;
　　5)RT-PCR檢測生殖細胞MVH,Dazl,透明帶基因Zp1、Zp2、Zp3的表達,干細胞基因Oct4,聯(lián)會復合體基因SCP3的表達。
　　結果：
　　1)卵巢上皮存在著Brdu/MVH雙標表達陽性的細胞;
　　2)體外分離培養(yǎng)2d形成散在的小而圓形或卵圓形的細胞,多數(shù)處于分裂狀態(tài),隨著培養(yǎng)的延長細胞聚集成簇;
　　3)免疫組化及熒光顯示SSEA-1,Oct4和Brdu/MVH雙標表達陽性,堿