小鼠卵巢中生殖干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定.pdf

1、研究背景：
　　性腺作為傳遞遺傳物質(zhì)的唯一組織,在睪丸中已經(jīng)證實(shí)有生殖系干細(xì)胞,即精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells,SSCs)的存在,并成功進(jìn)行了體外培養(yǎng),通過生精過程產(chǎn)生精子。但是,在卵巢中,雌性生殖干細(xì)胞的存在(female germline stem cells,FGSCs)仍然有爭(zhēng)議。
　　傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為:卵母細(xì)胞的數(shù)量在出生后的數(shù)量是固定存在的,雌性哺乳動(dòng)物卵泡池中不存在一種能增殖的生

2、殖細(xì)胞。這一觀點(diǎn)持續(xù)了半個(gè)多世紀(jì),然而,在2004年Johnson等經(jīng)過測(cè)定小鼠不同天數(shù)未閉鎖卵泡數(shù)和閉鎖卵泡數(shù),發(fā)現(xiàn)卵泡閉鎖的發(fā)生率要高于卵泡數(shù)量的減少率,因此推測(cè)卵巢組織內(nèi)存在有增殖活性的生殖細(xì)胞,這一觀點(diǎn)打破了傳統(tǒng)觀的生殖細(xì)胞的理論。在其后,不同的學(xué)者紛紛利用不同的方法進(jìn)行反復(fù)的驗(yàn)證,其中最有意義的是Zou等通過MVH標(biāo)記進(jìn)行磁珠分選,獲得的生殖細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)其具有增殖的潛能,轉(zhuǎn)染GFP標(biāo)簽后原位移植生殖細(xì)胞毀損鼠,與雄性

3、交配后產(chǎn)下正常的轉(zhuǎn)基因GFP小鼠。White等成功通過流式細(xì)胞(FACS)分選小鼠和人類的GSCs,又通過GFP標(biāo)記GSCs,移植至小鼠卵巢內(nèi),獲得GFP陽(yáng)性的卵母細(xì)胞。然而有些學(xué)者仍然堅(jiān)持著傳統(tǒng)的觀點(diǎn),ZhangH等通過內(nèi)源性的基因的方法和多種熒光Rosa26,Ddx4-Cre體外追蹤生殖干細(xì)胞的方法,結(jié)果未發(fā)現(xiàn)表達(dá)Ddx4有增殖活性的生殖細(xì)胞。
　　因此,卵巢組織內(nèi)是否存在FGSCs,仍然存在著巨大的爭(zhēng)議。本研究試圖通過定位小

4、鼠卵巢內(nèi)增殖的生殖細(xì)胞,再聯(lián)合膠原酶和胰酶消化卵巢及利用差異貼壁法進(jìn)行細(xì)胞的分離純化,采用與SSCs相似的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞,并利用卵泡液的性質(zhì)尋找FGSCs的分化能力,并鑒定其生物學(xué)特性。
　　目的：
　　分離、培養(yǎng)、鑒定卵巢中的雌性生殖干細(xì)胞,并進(jìn)一步探討其分化能力,為生殖干細(xì)胞的存在提供證據(jù)。
　　方法：
　　1)利用Brdu和MVH雙標(biāo)免疫熒光定位體內(nèi)具有增殖活性的生殖細(xì)胞;
　　2)取2～5d新

5、生鼠卵巢組織,膠原酶、胰蛋白酶聯(lián)合消化獲得單個(gè)細(xì)胞懸液,取12.5d孕鼠的胎鼠獲得胚胎成纖維細(xì)胞(MEF),以5×104個(gè)/mL,接種于24孔培養(yǎng)板,做為飼養(yǎng)細(xì)胞,添加不同生長(zhǎng)因子的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,觀察細(xì)胞的形態(tài);
　　3)免疫熒光及組化檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)記物Oct4、SSEA-1,生殖細(xì)胞標(biāo)記物MVH,Brdu-MVH雙標(biāo)的表達(dá);
　　4)向處于減數(shù)分裂時(shí)的細(xì)胞中添加人卵泡液,觀察細(xì)胞的分化形態(tài);并鑒定其分化

6、功能;
　　5)RT-PCR檢測(cè)生殖細(xì)胞MVH,Dazl,透明帶基因Zp1、Zp2、Zp3的表達(dá),干細(xì)胞基因Oct4,聯(lián)會(huì)復(fù)合體基因SCP3的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1)卵巢上皮存在著Brdu/MVH雙標(biāo)表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞;
　　2)體外分離培養(yǎng)2d形成散在的小而圓形或卵圓形的細(xì)胞,多數(shù)處于分裂狀態(tài),隨著培養(yǎng)的延長(zhǎng)細(xì)胞聚集成簇;
　　3)免疫組化及熒光顯示SSEA-1,Oct4和Brdu/MVH雙標(biāo)表達(dá)陽(yáng)性,堿