小鼠乳腺癌干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定.pdf

1、近5年來，在實體腫瘤干細(xì)胞研究領(lǐng)域取得了矚目的成就，越來越多的研究證實在乳腺癌、腦腫瘤、皮膚癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肝癌等實體瘤中存在著腫瘤干細(xì)胞，極大地促進了人們對腫瘤起源的認(rèn)識和治療觀念的變革。但腫瘤干細(xì)胞數(shù)量上的稀少和不斷分化的特性，阻礙了進一步的分子水平上的研究。而現(xiàn)有的分離和鑒定方法，利用細(xì)胞表面標(biāo)記物和干細(xì)胞排染能力，所鑒定出來的只是富含腫瘤干細(xì)胞的一群細(xì)胞，不是真正意義上的單個細(xì)胞即可致瘤的腫瘤干細(xì)胞，尚缺乏令人信服的實驗證

2、據(jù)來支持腫瘤干細(xì)胞理論。本研究以腫瘤干細(xì)胞理論為依據(jù)，在體外懸浮培養(yǎng)富集致瘤性腫瘤細(xì)胞的基礎(chǔ)上，探索聯(lián)合應(yīng)用化療藥物篩選乳腺癌干細(xì)胞的可行性。 1、無血清懸浮培養(yǎng)分離和體外擴增致瘤性小鼠乳腺癌TM40D細(xì)胞 【目的】無血清懸浮培養(yǎng)TM40D小鼠乳腺癌細(xì)胞，富集致瘤性腫瘤細(xì)胞。 【材料與方法】直接適應(yīng)法無血清培養(yǎng)TM40D細(xì)胞，分選出CD44+CD24-和CD44+CD24+亞群，每群中一半細(xì)胞無血清培養(yǎng)，另一半細(xì)

3、胞有血清培養(yǎng)，連同懸浮培養(yǎng)的TM40D細(xì)胞，測定連續(xù)傳代時其中假定的乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記物CD4.4+CD24-的表達(dá)。免疫組化檢測TM40D細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和CD44+CD24-細(xì)胞a-平滑肌肌動蛋白(a-SMA)和細(xì)胞角蛋白(CK)18表達(dá)。膜聯(lián)蛋白V(Annexin-V)異硫氰酸熒光素(FTTC)/碘化丙啶(PI)法檢測細(xì)胞凋亡。 【結(jié)果】TM40D細(xì)胞能直接適應(yīng)無血清懸浮培養(yǎng)，第4天時約77％的細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死，第5天出

4、現(xiàn)腫瘤球。TM40D細(xì)胞中CD44+CD24-比例約為1.2％，TM40D懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和分選的CD44+CD24-細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時，隨著傳代次數(shù)的增加，其中CD44+CD24-比例顯著增加，至第10代時為最多(分選的CD44+CD24-中達(dá)85.17％，TM40D細(xì)胞中為77％)，以后比例趨于穩(wěn)定。TM40D細(xì)胞貼壁培養(yǎng)時表達(dá)mSMA和CK18，懸浮培養(yǎng)時則失去表達(dá)。 【結(jié)論】懸浮培養(yǎng)能富集假定的CD44+CD24-乳腺癌干細(xì)胞群

5、，保持一定的未分化狀態(tài)，乳腺癌細(xì)胞體外懸浮生長模式圖可以很好地解釋乳腺癌干細(xì)胞在無血清培養(yǎng)條件下的體外擴增。 2、懸浮培養(yǎng)聯(lián)合化療藥物篩選乳腺癌干細(xì)胞 【目的】在懸浮培養(yǎng)基礎(chǔ)之上，確定適宜的化療藥物濃度篩選出乳腺癌干細(xì)胞【材料與方法】取第10代懸浮培養(yǎng)細(xì)胞作為實驗對象，用不同血藥峰濃度(PPC)的聯(lián)合化療藥物紫杉醇和表柔比星處理24小時，然后繼續(xù)無血清培養(yǎng)，7天后Annexin-VFITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡。

6、【結(jié)果】1 PPC和0.5 PPC細(xì)胞全部凋亡，0.25 PPC和0.1 PPC細(xì)胞在檢測期內(nèi)出現(xiàn)增殖形成細(xì)胞球。0.35 PPC細(xì)胞98％以上凋亡。 【結(jié)論】0.35 PPC細(xì)胞符合既定篩選標(biāo)準(zhǔn)，用于動物致瘤實驗。 3、乳腺癌干細(xì)胞的動物致瘤實驗 【目的】觀察所篩選細(xì)胞的體內(nèi)致瘤能力。 【材料與方法】將0.35 PPC細(xì)胞以不同的數(shù)量接種于免疫功能正常或抑制的BALB/C小鼠腹壁皮下，觀察腫瘤生長情況。

7、同時設(shè)CD44+CD24-和CD44+CD24+細(xì)胞為對照組。所有標(biāo)本組織經(jīng)病理切片檢查。 【結(jié)果】接種0.35 PPC細(xì)胞1個時，10只免疫功能正常小鼠中有1只，10只免疫功能抑制小鼠中有2只生成乳腺癌。無論小鼠免疫功能正常與否，接種1000、100個CD44+CD24+細(xì)胞時均無腫瘤生成。接種CD44+CD24-細(xì)胞1000、100個時，7只免疫功能正常小鼠中分別有7只扣5只長出腫瘤。而接種10個CD44+CD24-細(xì)胞時7