一種新的金龜子綠僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶的純化、特性及基因克隆.pdf

1、本文以金龜子綠僵菌蝗變種（Metarhizium anisopliae var. Acridum ）CQMa102菌株為研究材料，用酪蛋白從液體培養(yǎng)基中誘導出一條pI為9.45的磷酸酶，純化后酶特性研究表明是一種嗜熱酶。該酶的氨基酸序列分析表明其與真菌堿性磷酸酶同源，但其底物特異性、酶抑制劑的專一敏感性和含有酪氨酸蛋白磷酸酶的標志序列證明這是一個新的酪氨酸蛋白磷酸酶。而且，該酶在體外能改變其寄主（蝗蟲）血淋巴中與信號傳導相關(guān)的蛋白（To

2、ll-like receptor）的磷酸化狀態(tài)，進而可能干涉寄主體內(nèi)免疫活動，這為設(shè)計和改造新的真菌殺蟲劑提供一種新的技術(shù)途徑，具有重要的理論與應(yīng)用價值。 全文的主要結(jié)論如下： 一、發(fā)酵條件研究 采用單因子實驗分析培養(yǎng)條件對綠僵菌生長及產(chǎn)酸性磷酸酶的影響，結(jié)果表明，有機氮、葡萄糖和蛋白有機磷有利于綠僵菌生長和產(chǎn)酸性磷酸酶。酸性磷酸酶同工酶分析表明，酪蛋白作為磷源培養(yǎng)綠僵菌時，有一條比較特別的磷酸酶帶出現(xiàn)，其pI為

3、9.45，明顯不同于其他磷源。因此，我們選擇了這條磷酸酶帶為我們純化的目標。根據(jù)實驗結(jié)果確定了純化目標蛋白的培養(yǎng)條件為：葡萄糖，20g/L；(NH4)2SO4，2g/L；酪蛋白，4g/L；KCl，0.5g/L；MgSO4，0.5g/L；微量元素混合液，10ml/L；接種量，1×107孢子/100ml培養(yǎng)基；裝液量，100ml；10g/LMES，pH 6.0；在27°C條件下振蕩（160rpm）培養(yǎng)78h。 二、蛋白純化及特性研究

4、 培養(yǎng)液經(jīng)過ConA-Sepharose親和層析、HighQ陰離子交換層析和25S陽離子交換層析后，得到均一性好，純度高的目標蛋白，回收率達41％。電泳法測定蛋白的pI為9.45，分子量為82.5kDa，用TMSF去糖基后表觀分子量為69kDa，因此該蛋白含碳水化合物16.4％。酶底物特異性研究表明該磷酸酶對磷酸酪氨酸殘基底物專一性強，而且絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶抑制劑（EDTA 、NaF和岡田酸）、酸性磷酸酶抑制劑（EDTA、

5、酒石酸鈉）和堿性磷酸酶抑制劑（EDTA）對酶酶解pNPP和O-phospho-L-tyrosine活性沒有明顯的抑制作用；但酪氨酸蛋白磷酸酶抑制劑（鉬酸鈉、原釩酸鈉、N-乙基馬來酰亞胺和鎢酸鈉）顯著抑制酶對O-phospho-L-tyrosine的酶解活性，因此該磷酸酶應(yīng)該是酪氨酸蛋白磷酸酶。該酶的最適作用溫度大約是75°C，最適pH是5.5，熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性好。除Ni2+外，Ca2+、Co2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Mn2

6、+和Ba2+在5mM以上都明顯抑制酶降解pNPP的活性。Zn2+、Fe2+、Cu2+和Ag+顯著抑制酶水解O-phospho-L-tryosine的活性，而Mn2+和Ba2+顯著促進酶水解O-phospho-L-tryosine活性，Co2+、Ni2+、Ca2+和Mg2+對酶水解O-phospho-L-tryosine活性沒有明顯影響。 三、酪氨酸蛋白磷酸酶基因克隆及分析 酶蛋白經(jīng)肽指紋質(zhì)譜分析和肽段質(zhì)譜de novo測

7、序，得到了五個肽段的氨基酸序列：NIQYGTGVNFPSNWEPR，DITNFFGVKEPEVEK，GNDSALDLPGLK， ALGDLLELDDTVR，WYEDLFAEDK。根此設(shè)計兼并引物，從綠僵菌DNA中擴增出一條72bp的核酸片段。用該核酸片段作為探針，用32P末端標記，結(jié)合PCR方法，從綠僵菌基因組文庫中篩選出了含該磷酸酶DNA的陽性克隆。其核酸序列分析結(jié)果表明，該基因DNA上含有3個內(nèi)含子，都是典型的GT……AG結(jié)構(gòu)，三段

8、內(nèi)含子的長度都比較短，共182bp，占該基因核酸總量的7.3％。該基因的啟動子特征不很明顯，但含有TATAA box轉(zhuǎn)錄起始框，和TGACGCCA和TGATAA轉(zhuǎn)錄激活序列，表明這是一個啟動子。再利用RACE法克隆該酶的cDNA，共2287bp，編碼一個含684個氨基酸的蛋白質(zhì)，其中包含質(zhì)譜測序獲得的5個肽段氨基酸序列，證明克隆正確。同時該氨基酸序列中包含有酪氨酸蛋白磷酸酶的標志序列HCX5R(S/T)，從分子水平證明該酶是酪氨酸蛋白磷

9、酸酶。 ORF編碼的氨基酸序列在http://www.expasy.org/tools/網(wǎng)站上信號肽分析結(jié)果顯示，該序列包含有一明顯的信號肽LAKLNVAAVLAASLSVVSA，這段肽疏水性強，擁有跨膜螺旋。其切割位點特征突出，在切割位點的C-端有一個帶有很短側(cè)鏈的丙氨酸。推導氨基酸序列的糖基化位點分析表明該酶蛋白是以N-連接型糖基化基團為主，基本不含O-連接型糖基化基團。這也得到實驗證實。因為TMSF是去的N-連接型，而不去