昆蟲病原真菌金龜子綠僵菌酸性海藻糖酶分離純化、特性及其基因克隆的研究.pdf

1、金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)是一類應(yīng)用廣泛的昆蟲病原真菌，在昆蟲防治中起著重要作用。與化學(xué)農(nóng)藥相比，真菌殺蟲劑盡管安全，無環(huán)境污染，但存在著殺蟲速率緩慢的弱點(diǎn)，這在很大程度上阻礙了真菌殺蟲劑的應(yīng)用。對(duì)昆蟲病原真菌致病機(jī)制進(jìn)行研究可為發(fā)展新型高效真菌殺蟲劑提供依據(jù)。海藻糖是一種非還原性二糖，存在于所有已知種類的昆蟲中，是昆蟲血淋巴中主要的糖類(大約占80-90﹪)；海藻糖在昆蟲血液生理中起著重要的作用，其耗竭

2、可能對(duì)昆蟲起著致命性的作用。蟲生真菌侵染進(jìn)入昆蟲血腔后，昆蟲血淋巴中的海藻糖成為真菌生長(zhǎng)潛在和必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。但海藻糖對(duì)許多真菌來說是非滲透性二糖，必須在相應(yīng)的二糖水解酶作用下分解為葡萄糖才能被真菌利用。金龜子綠僵菌侵染進(jìn)入昆蟲血淋巴后，能分泌酸性海藻糖酶，有效地降解昆蟲血淋巴中的海藻糖。酸性海藻糖酶在真菌對(duì)昆蟲的致病過程中起著重要的作用。 目前對(duì)真菌酸性海藻糖酶的研究較少，只有少數(shù)幾個(gè)物種中酸性海藻糖酶基因被克隆并測(cè)定序列。研

3、究發(fā)現(xiàn)酸性海藻糖酶與中性海藻糖酶之間不具同源性，并且不同酸性海藻糖酶基因之間序列同源性很差。這為酸性海藻糖酶的研究增加了難度。在蟲生真菌中，還未見酸性海藻糖酶基因克隆方面的報(bào)道。本研究以金龜子綠僵菌(M.anisopliae)菌株CQMa102和東亞飛蝗為研究材料，對(duì)綠僵菌酸性海藻糖酶培養(yǎng)條件和同工酶進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，并在此基礎(chǔ)上采用離子交換、分子篩層析等技術(shù)手段分離純化出綠僵菌酸性海藻糖酶蛋白，對(duì)其分子量、等電點(diǎn)以及其它酶學(xué)特性進(jìn)行了

4、詳細(xì)的研究。在純化的蛋白氨基酸測(cè)序的基礎(chǔ)上，通過設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，對(duì)構(gòu)建的綠僵菌基因組文庫和隨后的亞克隆進(jìn)行了放射性同位素篩選，結(jié)合RACE等技術(shù)手段，成功分離出綠僵菌酸性海藻糖酶基因并登錄NCBI的GenBank，登錄號(hào)為：DQ237957(基因組序列)，DQ237958(cDNA序列)。同時(shí)對(duì)綠僵菌酸性海藻糖酶在真菌侵染過程中的作用進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究。研究的結(jié)果為進(jìn)一步利用基因工程手段改造病原真菌、提高生物防治效果奠定了基礎(chǔ)。主要

5、研究結(jié)果如下： 1.利用產(chǎn)物(葡萄糖)測(cè)定法，以酶活和同工酶為指標(biāo)，篩選出適合CQMa102酸性海藻糖酶產(chǎn)酶的培養(yǎng)基和產(chǎn)酶條件如下： 培養(yǎng)基：1.0g/LKH2PO4，0.5g/LMgSO4，1.0g/LKCl，10g/L可溶性淀粉，5g/L蛋白胨，5g/L酵母浸膏，pH值調(diào)至6.0。把1.0ml1.0-3.0×107個(gè)/mlCQMa102孢子懸液接種到100ml上述培養(yǎng)基中，在26℃、150rpm的條件下振蕩培養(yǎng)3天，

6、海藻糖水解酶總活性可達(dá)到14.125U/L，比活可達(dá)到0.4344U/mg。在該培養(yǎng)條件下，綠僵菌產(chǎn)生兩種海藻糖降解酶同工酶，其中一個(gè)等電點(diǎn)為8.4，而另一個(gè)為4.7。 2.經(jīng)優(yōu)化的純化用產(chǎn)酶培養(yǎng)基為：1.0g/LKH2PO4，0.5g/LMgSO4，1.0g/LKCl，2g/L(NH4)2SO4，10g/L可溶性淀粉，10g/LMES，初始pH6.10。每100ml培養(yǎng)液接種3×107孢子。培養(yǎng)液在開放式搖床上150rpm振蕩

7、培養(yǎng)72小時(shí)，培養(yǎng)溫度為26-27℃。 3.通過比較CQMa102菌絲提取液和濾液中海藻糖水解酶的活性，確定了海藻糖水解酶在真菌細(xì)胞中的位置。結(jié)果表明：CQMa102海藻糖水解酶是分泌性蛋白，主要分泌到培養(yǎng)基中，很少結(jié)合在細(xì)胞壁上。 4.經(jīng)過兩步陰離子交換層析，一步分子篩層析和一步窄范圍等電聚焦分離，得到了純化的酸性海藻糖酶。該蛋白經(jīng)SDS-PAGE和等電聚焦電泳(IEF)后，銀染，均顯示為單一染色條帶。該蛋白為糖蛋白，

8、在SDS-PAGE上分子量為170kDa，等電點(diǎn)為4.7。經(jīng)去糖基化處理后，分子量降為130kDa左右。該酸性海藻糖酶最適pH為5.5，最適反應(yīng)溫度為30℃。其IC50為1.3×10-8M。純化的綠僵菌酸性海藻糖酶米氏常數(shù)(Km)為2.3mM，最高酶促反應(yīng)速度(Vmax)為0.412mmolmin-1×mgprotein-1(以海藻糖為底物)。該純化的酶在40℃孵育4小時(shí)，活性沒有變化；在50℃條件下，隨孵育時(shí)間延長(zhǎng)，酶活性線形降低；當(dāng)

9、孵育溫度超過60℃，酶迅速失去活性。該海藻糖酶具有很高的底物專一性，在測(cè)試的8種二糖中，只對(duì)海藻糖有催化活性。Trehazolin，一種海藻糖酶特異性抑制劑，能有效地抑制該酶活性。 5.Edman降解法測(cè)定酸性海藻糖酶前15個(gè)氨基酸序列為：RDRVAKYKARYSGSG。酸性海藻糖酶蛋白nano-ESI-MS/MS分析，獲得6段多肽片斷氨基酸序列，分別為：YSGSGLDWN；DSDVKSVWHR；NAASSALSQGFYK；GD

10、VAGLPFLQVDK；PHTLLLTGDLLAGQR；WVQASGDAFDDPKQVAK。 6.成功構(gòu)建了綠僵菌基因組DNA文庫，文庫插入片段大小平均為40kb。 7.根據(jù)肽段：WVQASGDAFDDPKQVAK設(shè)計(jì)寡核苷酸猜測(cè)子探針：5’TGGGTCCAGGCCTCTGGTGATGCCTTTGATGACCCTAAGCAGGTTGCCAAG3’，以該探針對(duì)綠僵菌DNA文庫和隨后的亞克隆進(jìn)行放射性同位素篩選，結(jié)合RACE

11、等技術(shù)手段分離出綠僵菌酸性海藻糖酶基因，其GenBank登錄號(hào)分別為DQ237957(DNA序列)和DQ237958(cDNA序列)。酸性海藻糖酶基因含有2個(gè)內(nèi)含子，其開放閱讀框(ORF)編碼一個(gè)含1073個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，該酸性海藻糖酶具有一個(gè)20個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列和含有30個(gè)可能的N-糖基化位點(diǎn)(Asn-Xaa-Ser/Thr)。NCBI序列比對(duì)(Blastn)顯示該蛋白與Aspergillusfunigatux的alpha,al

12、phatrehaloseglucohydrolase，Aspergillusnidalans的酸性海藻糖酶前體和Talaromycesemrsonii的酸性海藻糖酶分別有62﹪、59﹪和57﹪的氨基酸相似性；同時(shí)與另外兩個(gè)真菌Saccharomycescerevisiae(Ath1p)和Candidaalbicans(Atc1p)的酸性海藻糖酶也具有約25﹪的氨基酸同源性。將該酸性海藻糖酶基因命名為ATM1，即foracidtrehal

13、aseofMetarhiziumanisopliae，相應(yīng)蛋白為Atmp1。 8.東亞飛蝗感染綠僵菌后，血淋巴中海藻糖含量急劇下降，但是葡萄糖含量并未上升，反而與對(duì)照相比有所降低。對(duì)感染后蝗蟲血淋巴進(jìn)行海藻糖酶同工酶分析(5﹪窄范圍等電聚焦電泳)發(fā)現(xiàn)感染血淋巴中新出現(xiàn)一條同工酶帶，該條帶與純化出的酸性海藻糖酶具有相同的等電點(diǎn)和底物特異性。同時(shí)，離體實(shí)驗(yàn)也表明純化的酸性海藻糖酶能夠有效降解血淋巴中海藻糖為葡萄糖。 9.RT