金龜子綠僵菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及轉(zhuǎn)化子特性分析.pdf

1、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文金龜子綠僵菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及轉(zhuǎn)化子特性分析姓名：王曉玲申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：農(nóng)業(yè)微生物學(xué)指導(dǎo)教師：張澤華20070601A b s t r a c tM e t a r h i z i u m a n i s o p l i a eS o T O H nh a sb e e nw i d e l ya p p l i e di n b i o l o g i c a lc o n t r o lo f t

2、 h ea g r i c u l t u r a la n d f o r e s t r yp e s t s ．w h i c hi s a l s o t h em a i n f o c u so f t h em i c r o b i a lp e s t i c i d ea tp r e s e n L 肛a n i s o p l ／a eh a s a衄o f a d v a n t a g e so v e r

3、t h ec o n v e n t i o n a lc h e m i c a lp e s t i c i d e s ：b r o a dh o s tr a n g e ，h i g hp a t h o g e n i c i t y ，a n dn O t o x i c i t yt o h u m a nb e i n g ，l i v e s t o c k ，a n dc r o p s ．S o i t c a

4、n b eu s e dw i d e l yf o rk i l l i n gt h ep e s ti nf u t u r e ．B u t t h en a t u r a li s o l a t eh a s l o w v i r u l e n c eo ra d a p tt h ee n v i r o n m e n tp o o r l y , S Oi tC e no n l yb eu s e d f o

5、rb i o l o g i c a l c o n t r o la f t e ri m p r o v e m e n LT h e p r e s e n ts t u d yi n v e s t i g a t e dt h ep r o t o p l a s tp r e p a r a t i o na n dt h ee s t a b l i s l L m e n to ft r a n s f o r m a

6、t i o ns y s t e mo f j l f ．a(chǎn) n ／a o p l ／a e 【M 1 3 3 0 1 8 9 ．T h eb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f s t a b l et r a n s f o r m a n t s w e T ea l s oi n v e s t i g a t e d ．T h ep r e s e n ts t

7、u d yp r o v i d e dS O I I tr e f e r a n c e sf o rt h er e s e a r c ho fg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o no f肛a n i s o p l i a e ．T h e m a i n r e s u l t s o f p r e s e n ts t u d ya r e 私f o l l o w s ：M y

8、 c e l i u mW a s c o l l e c t e db y t w o ·s t e p sc e l m r e s ，a n dt h e ni t w a s p r o c e s s e d f o r5 h w i t h p r o t o p l a s tb u f f e ra t3 0 “ C ，0 ．7m o g L N a C ls o l u t i o nw a s u s e

9、d a so s m o s i ss t a b i l i z e r , 5 - - 6 ×l O 。7 - l O S s pp r o t o p l a s t 怛w e t m y c e l i u mw a g f o r m e d a n dr e g e n e r a t i o nr a t e W a S1 5 ％．T h e g e n e t i ct r a n s f o r m a t

10、i o ns y s t e mo f 肛a n i s o p l i a e W a s c o n s t r u c t e db y P E G - m e d i a t e dp r o t o p l a s ta n dG 4 1 8W a S u s e d a s s e l e c t i o n n l a r l 【e L 肛a n ／s o p l ／a eg r o w t hw a si n h i b

11、 i t e x l c o m p l e t e l yw h e nt h em e d i u m c o n t a i n e d 3 0 0 “g ／m lG 4 1 8 ．T h e r e s u l t so f s e n s i t i v i ￡ye x a m i n a t i o n ss h o w e d t h a t t h ee f f i c i e n c yo ft r a n s f o

12、 r m a t i o nW a s1 5 - 2 3t r a n s f o r m a n t s ，燼v e c t o r D N A w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fG 4 1 8W a s 3 0 0 pg ／m L ．a(chǎn) n dt r a n s f o r m a n t s e 】【i s t e d s t a b l y ．砧ec o n s t r u c t

13、i o n o fM a n i s o p l i a et r a n s f o r m a t i o n s y s t e mo fP E G - m e d i a t e d l a i da g o o d f o u n d a t i o nf o rr e s e a r c h i n gt h e 膨a n ／s o p l ／a ef r o mt h em o l e c u l a r l e v e

14、l a n dg a i n i n gs t a b l e , a n de f f e c t i v er e c o m b i n a n t s t r a i n ．T h i sr e s e a r c h m a i n l y f o c u s o nt h e o p t i m a l m e d i u m , g r o w t h s p e e d ，s p o r e p r o d u c t

15、i o n ，a n dp a t h o g e n e c i t yo f s t a b l e t r a n s f o r m a n t s ．T h er e s u l tm a n i f e s t e da sf o l l o w s ：1 ．P D A Y w a s t h eb e s tm e d i u mf o rt h e o p t i m a lm e x i i u ma f t e r

16、s e l e c t i o nr e s e a r c h ．2 ．T h e d a i l yr a t e o fg r o w t ho ft r a n s f o r m a n t sw h i c hW e r e l o w e rt h a nC l 【’v a r i e df r o m3 ．3 0t o3 ．7 9 m m , c o m p a r e d t oC K ( 3 ．8 5 r a m )

17、 ．F a s t e rg r o w t h p r e s e n t e di n t r a n s f o r m a n t sT M I a n d T M 3 i nc o n t r a s t t o T M 6 0 f 3 ．8 5 蝴．1 3 m n l ．t h e n u m b e r W a s 3 ．7 8 ：L - 0 ．0 2 m ma n d3 ．8 1 2 q 3 ．0 7 m m r e s

18、 p e c t i v e l y ．3 ．A s f o r t h e s p o r e p r o d u c t i o n ．t h e t r a n s f o r m a n t s p r o d u c e d0 ．6 8 - 1 ．7 2 ×1 礦s p ，m 1 ．C o m p a r e dt ot h ec o n 仃o l ，t h ep r o d u c t i o no f T M 2

19、 W a s h i g h e rt h a nt h ec o n t r o lb u td i dn o t s h o wt h er e m a r k a b l ed i f f e r e n c e ．4 ．田“ r e s u l tO nv i r u l e n c eo ft r a n s f o r m a n t sm a n i f e s t e d t h a tT M l 9a n dT M 2

20、 0 s h o w e dr e m a r k a b l ed i f f e r e n c e i nU ‰b e i n go f 8 ．4 3 4 0 d a n d8 ．3 0 6 7 dr e s p e c t i v e l y ，c o m p a r e dt oo t h e r t r a n s f o r m a n t a n t s ．T h eL e t h a lc e n t e rs h o

21、 w e dl o n g e rt h a no t h e rs t r a i n ．T h e r e f o r e ，t h ep a t h o g e n i ce f f i c a c i t yo f t w o s w a i n si sw P ．a(chǎn) k g * t o L m i g r a t o r i a ．P E G - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o

22、 ns y s t e mc o n s t r u c t e d i n t h ep r e s e n t s m d yw o u l db eh e l p f u l f o r t h es t u d y o f g e n e t i c t r a n s f o r m a t i o n a n d t h e c l o n e o f p a t h o g e n i c g e n e so t M ．