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文檔簡(jiǎn)介
1、自交不親和(Self-incompatibility,SI)是被子植物中廣泛存在的促進(jìn)異花授粉,防止近親繁殖的遺傳機(jī)制。柑桔無(wú)籽是一種優(yōu)良的經(jīng)濟(jì)性狀,自交不親和是導(dǎo)致無(wú)籽的重要原因之一。研究表明,自交不親和反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,可能涉及到泛素降解途徑、Ca2+信號(hào)途徑、發(fā)育過(guò)程和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種途徑。本研究以無(wú)籽沙糖桔和有籽沙糖桔為材料,利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),結(jié)合已發(fā)表的與自交不親和相關(guān)的基因,篩選出與無(wú)籽沙糖桔自交不親和相關(guān)的候選
2、基因14個(gè),并用q-PCR對(duì)候選基因進(jìn)行時(shí)空表達(dá)分析。主要研究結(jié)果如下:
1.以無(wú)籽沙糖桔和有籽沙糖桔的雌蕊、花粉,無(wú)籽沙糖桔自交、異交后不同時(shí)段的雌蕊(4 h,1~7 d)六個(gè)樣品用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。共獲得35.67 G堿基,306,462,978對(duì)雙端reads,樣品Q20達(dá)到96%以上,N50為1549,Unigene平均長(zhǎng)度897.99bp。各樣品reads數(shù)與組裝參考基因組比對(duì)率均在85%左右,測(cè)序數(shù)據(jù)可靠,可以滿足后續(xù)
3、實(shí)驗(yàn)分析需要。
2.根據(jù)表達(dá)量RPKM值及注釋信息,以FDR≤0.001且倍數(shù)差異不低于2倍為篩選條件,在WCPistils-VS- WSPistils中篩選出634條顯著差異基因,其中541條上調(diào)表達(dá),93條下調(diào)表達(dá);在YPistils-VS-WPistils中篩選出6555條顯著差異基因,其中2643條上調(diào)表達(dá),3912條下調(diào)表達(dá);在YPollen-VS-WPollen中篩選出2869條顯著差異基因,其中634條上調(diào)表達(dá),
4、2235條下調(diào)表達(dá)。GO功能注釋結(jié)果表明,這些差異基因涉及到生殖過(guò)程、信號(hào)傳遞、免疫過(guò)程、刺激應(yīng)答、分子功能的正負(fù)調(diào)控、受體活性和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合蛋白活性等方面。KEGG注釋結(jié)果表明,這些差異基因主要涉及到植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、泛素/26S蛋白酶體途徑、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)以及半胱氨酸和甲硫氨酸代謝等通路。與泛素/26S蛋白酶體途徑密切相關(guān)的基因主要有:泛素激活酶 E1(Unigene0031440);泛素結(jié)合酶E2(Unigene0049541和Uni
5、gene0034845)和泛素連接酶 E3(Unigene0038751、Unigene0031435、Unigene0034401、Unigene0029897、Unigene0023597和Unigene0035181)。
3.根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道并結(jié)合華中甜橙數(shù)據(jù)庫(kù)、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)和SSH cDNA文庫(kù)篩選到SSK-21、SSK-62、SSK-98、Cullin67和Ring5個(gè)與SI、泛素/26S蛋白酶體途徑相關(guān)的候選基因。<
6、br> 4.利用q-PCR對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證,在鑒定的43個(gè)差異基因中,有88.4%的表達(dá)趨勢(shì)與RNA-Seq結(jié)果一致,說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。
5.用q-PCR對(duì)14個(gè)候選基因,在無(wú)籽沙糖桔、有籽沙糖桔不同組織以及無(wú)籽沙糖桔自交和異交授粉后不同時(shí)段(4 h,1、2、3、4、5、6和7 d)和不同組織(柱頭、花柱、子房)進(jìn)行表達(dá)特性分析,Unigene0031435、Unigene0038751、Unigene002989
7、7和Ring基因,在異交3 d后的花柱中上調(diào)表達(dá),且都具有RING-finger結(jié)構(gòu)域,符合預(yù)期表達(dá)趨勢(shì)。表達(dá)特性表明,Unigene0031435、Unigene0038751和Unigene0029897可能是泛素/26S蛋白酶體途徑中關(guān)鍵酶基因。
6.對(duì)Ring基因做進(jìn)一步生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)該基因與可可(Theobroma cacao)的同源性最高(90.0%),且與擬南芥(Arabidopsis thaliana)M
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