人工絲素重鏈(artFibH)的設(shè)計及轉(zhuǎn)基因家蠶品系的構(gòu)建.pdf

1、蠶絲是一種復(fù)雜的微細(xì)纖維集合性天然蛋白，因具優(yōu)良的特性被廣泛使用和研究。然而力學(xué)性能上的一些缺陷，使得蠶絲的應(yīng)用范圍具有局限性。因此，蠶絲纖維的改性是拓展應(yīng)用振興產(chǎn)業(yè)的當(dāng)務(wù)之急。蠶絲纖維的改性研究已有較長歷史，改性的方法可分為物理改性、化學(xué)改性和遺傳改性。物理和化學(xué)的改性方法只是對蠶絲進(jìn)行修飾，不能從本質(zhì)上改變蠶絲蛋白特性，且成本高、工序繁瑣。利用遺傳操作技術(shù)對蠶絲基因進(jìn)行人工改造，能夠獲得性能更優(yōu)良且可穩(wěn)定遺傳的新品系。蜘蛛絲是已知動

2、物纖維中力學(xué)性能最優(yōu)越的絲纖維，其蛋白特性、組分及成絲過程與蠶絲具有相似性，因此不斷有學(xué)者嘗試在家蠶絲腺中表達(dá)蜘蛛絲來提高蠶絲的力學(xué)性能，但外源基因表達(dá)量低一直是無法攻克的難題。如果能通過編輯蠶絲自身的基因來實現(xiàn)蠶絲性能的改良則是最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。研究發(fā)現(xiàn)蜘蛛絲重復(fù)區(qū)域序列較比蠶絲的更加規(guī)則有序，這可能是蜘蛛絲強(qiáng)于蠶絲的重要原因。絲素重鏈Fib-H基因是絲蛋白最重要的結(jié)構(gòu)基因，具有長片段的重復(fù)區(qū)域，決定著蠶絲力學(xué)性能。有研究者發(fā)現(xiàn)對Fi

3、b-H進(jìn)行截短后蠶絲的力學(xué)性能變差。那么，如果人為改造絲素重鏈?zhǔn)蛊湫蛄懈?guī)則，長度更長就有可能獲得保持天然特性的超強(qiáng)人工蠶絲。絲素重鏈高度重復(fù)和高GC含量的特性，使得利用常規(guī)的PCR技術(shù)和測序技術(shù)難以對其進(jìn)行簡單地克隆及編輯。因此，我們采用人工組裝基因的方法對此設(shè)想做了初步的探索。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴根據(jù)Fib-H基因的序列特征，我們選擇重復(fù)序列最長的第七個重復(fù)區(qū)（R07）和第六個非重復(fù)區(qū)（A06）作為一個重復(fù)單元，稱為“

4、A06R07”。為保證人工絲素重鏈保持原來的序列特征，我們選擇了兩個IIs型限制內(nèi)切酶：BbsI和BsaI，在基因的兩條鏈上各含有一個BbsI和一個BsaI的識別序列，并且均設(shè)計在質(zhì)粒載體上。BbsI識別序列設(shè)計在A06R07序列的下游，其中一個設(shè)計在“A06R07”兩個堿基之后，酶切后A06R07序列露出3'端TTGT末端；BsaI識別序列設(shè)計在A06R07序列的兩端，其中一個設(shè)計在 A06R07序列的上游五個堿基之前，酶切后A06R

5、07序列形成5'端AACA末端，另一個BbsI和BsaI識別序列之間相距7個堿基，二者共用一個酶切位點，切出的一對粘性末端正好堿基互補(bǔ)，利用酶切連接的方法實現(xiàn)重復(fù)單元之間無縫連接加倍。⑵經(jīng)酶切驗證，我們共成功構(gòu)建了由 Fib-H啟動子驅(qū)動人工 Fib-H基因的piggyBac轉(zhuǎn)基因載體如下：pBac[R01A06R07R12]、pBac[R01(A06R07)3R12]、pBac[R01(A06R07)5R12]、pBac[R01(A0

6、6R07)3-Red-R12]、pBac[R01(A06R07)3-SELR13-R12]。以家蠶實用品系932為受體材料，利用顯微注射技術(shù)，制備了轉(zhuǎn)基因家蠶。通過熒光觀察篩選到陽性個體。其中 pBac[R01(A06R07)3R12]有2個蛾圈，陽性蛾圈率為0.2%，pBac[R01(A06R07)5R12]有1個蛾圈，陽性蛾圈率為0.5%。⑶通過蛋白預(yù)測軟件分析3×型和5×型的人工Fib-H蛋白大小分別約為203KDa和295KDa

7、，均小于家蠶932品系Fib-H蛋白（350KDa）。通過SDS-PAGE銀染和Western Blot檢測，結(jié)果顯示預(yù)測目的條帶并不明顯，因此推測可能是由于其蛋白分子量太大而且具有自組裝的特性，而滯留在點樣孔中；通過冷凍切片技術(shù)獲得單根繭絲的橫截面直徑，結(jié)果顯示野生型與人工型繭絲形態(tài)和直徑并無明顯差異，表明 artFibH的插入不會影響繭絲的正常形態(tài)和直徑大??；通過應(yīng)力應(yīng)變拉伸試驗，結(jié)果顯示，與WT型相比，人工3×型和5×型繭絲伸長率