銅綠假單胞菌多重耐藥的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的： 了解銅綠假單胞菌多重耐藥性相關(guān)的分子機(jī)制。 方法： 1.收集我院各臨床科室標(biāo)本中分離出的銅綠假單胞菌（PA），用VITEK系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定，用K-B法進(jìn)行常規(guī)藥敏試驗(yàn)，從中篩選出多重耐藥的臨床分離PA共192株，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)研究： 2.采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行多重耐藥株對(duì)亞胺培南和美洛培南的最低抑菌濃度測(cè)定，改良的多重紙片擴(kuò)散法進(jìn)行多重耐藥株的金屬β內(nèi)酰胺酶（MBLs）的表型篩選，采用PCR方法進(jìn)行

2、MBLs相關(guān)基因和外膜蛋白缺失相關(guān)基因的擴(kuò)增，分析MBLs在本地區(qū)的主要流行型別以及產(chǎn)酶菌的耐藥譜； 3.采用CLSI推薦的方法對(duì)多重耐藥的銅綠假單胞菌進(jìn)行ESBLs表型檢測(cè)，同時(shí)采用PCR方法對(duì)其質(zhì)粒DNA和染色體DNA分別進(jìn)行ESBLs相關(guān)的基因擴(kuò)增，并將兩種方法檢測(cè)ESBLs的結(jié)果與PCR法藥敏結(jié)果進(jìn)行對(duì)照分析，以評(píng)價(jià)兩種不同方法在檢測(cè)銅綠假單胞菌產(chǎn)ESBLs的正確性。 4.對(duì)192株多重耐藥的銅綠假單胞菌臨床分離

3、株進(jìn)行第Ⅰ類(lèi)整合酶和Ⅰ類(lèi)整合子相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增檢測(cè)，將整合子擴(kuò)增產(chǎn)物按分子量大小進(jìn)行分類(lèi)整理，對(duì)其中部分產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，拼接出全長(zhǎng)基因序列后登陸Genebank。 結(jié)果： 1.192株多重耐藥的PA中以呼吸科分布最多，占41%，其次為ICU、燒傷科、血液科、外科及其它科室，分別為26%、17%、15%、6%和2%；各種臨床標(biāo)本中以痰液中多重耐藥的PA分離率最高，占60%，其次為燒傷創(chuàng)面38%，膿液11%，咽拭子4%

4、，引流液3%，血液2%。 2.微量肉湯稀釋法顯示，該192株多重耐藥的PA對(duì)亞胺培南和美洛培南的耐藥性非常嚴(yán)重，其MIC值大于8μg/ml者分別為95.3%和94.8%；改進(jìn)的紙片協(xié)同法共檢測(cè)出67株金屬β內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性株，根據(jù)其與底物及抑酶劑間協(xié)同環(huán)的類(lèi)型共分為4種不同表型；PCR方法共擴(kuò)增出65株金屬β內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性，其中IMP型44株，VIM型21株，該65株P(guān)A中有3株同時(shí)伴oprD2基因缺失，其余127株未擴(kuò)增出IMP和V

5、IM基因，但有14株oprD2基因缺失。 3.按CLSI推薦的ESBLs表型檢測(cè)方法對(duì)192株多重耐藥的PA進(jìn)行ESBLs檢測(cè)，其中6株ESBLs表型檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，占總菌株數(shù)的3.1%：用PCR方法對(duì)PA的染色體DNA和質(zhì)粒DNA分別進(jìn)行ESBLs相關(guān)的基因檢測(cè)，共檢測(cè)出123株TEM基因陽(yáng)性，占64.1%（123/192），10株SHV基因陽(yáng)性，占5.2%（10/192），ESBLs總陽(yáng)性率為69.3%（133/192），在質(zhì)

6、粒DNA和染色體DNA中均有ESBLs的基因分布；與K-B法藥敏結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，CLSI推薦的ESBLs表型檢測(cè)結(jié)果與PA的耐藥表型符合率較低而PCR方法檢測(cè)結(jié)果與PA的耐藥表型符合率較高，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果具有顯著性差異。 4.192株多重耐藥的PA進(jìn)行第Ⅰ類(lèi)整合酶基因擴(kuò)增，共有106株陽(yáng)性，陽(yáng)性率為55.2%；對(duì)第Ⅰ類(lèi)整合子相關(guān)的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，共有98株測(cè)得整合子相關(guān)基因組，陽(yáng)性率為51.0%，產(chǎn)物大小從800b

7、p至6000bp左右不等，根據(jù)其電泳圖譜可分為11種不同型別：部分PA中同時(shí)存在兩種或兩種以上的不同分子量大小的第Ⅰ類(lèi)整合子，部分位于質(zhì)粒DNA，部分位于染色體DNA，部分在質(zhì)粒DNA和染色體DNA中共存；對(duì)部分菌株的整合子擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序發(fā)現(xiàn)第Ⅰ類(lèi)整合子中多攜帶1～3種不同的耐藥基因盒，其中以aacA4基因分布最為廣泛，另有VIM-2、aadB、pse-1、arr-3等功能基因組分布于Ⅰ類(lèi)整合子中。 結(jié)論： 1.我院多重耐

8、藥的PA在各臨床科室分布廣泛，以ICU分離率最高；各種臨床標(biāo)本中，以痰液的分離率最高。 2.銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物具有多重耐藥性，其耐藥機(jī)制與產(chǎn)生金屬β-內(nèi)酰胺酶密切相關(guān)；改進(jìn)的紙片協(xié)同法對(duì)篩選PA臨床分離株產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)具有良好的應(yīng)用前景。 3.ESBLs在銅綠假單胞菌中檢出率高，是導(dǎo)致三代頭孢菌素耐藥的主要原因；CLSI推薦的ESBLs表型確證試驗(yàn)不適合PA產(chǎn)ESBLs的表型檢測(cè)，PCR方法對(duì)PA產(chǎn)ESBL