銅綠假單胞菌多重耐藥的分子機制研究.pdf

1、目的： 了解銅綠假單胞菌多重耐藥性相關(guān)的分子機制。 方法： 1.收集我院各臨床科室標本中分離出的銅綠假單胞菌（PA），用VITEK系統(tǒng)進行細菌鑒定，用K-B法進行常規(guī)藥敏試驗，從中篩選出多重耐藥的臨床分離PA共192株，進行如下實驗研究： 2.采用微量肉湯稀釋法進行多重耐藥株對亞胺培南和美洛培南的最低抑菌濃度測定，改良的多重紙片擴散法進行多重耐藥株的金屬β內(nèi)酰胺酶（MBLs）的表型篩選，采用PCR方法進行

2、MBLs相關(guān)基因和外膜蛋白缺失相關(guān)基因的擴增，分析MBLs在本地區(qū)的主要流行型別以及產(chǎn)酶菌的耐藥譜； 3.采用CLSI推薦的方法對多重耐藥的銅綠假單胞菌進行ESBLs表型檢測，同時采用PCR方法對其質(zhì)粒DNA和染色體DNA分別進行ESBLs相關(guān)的基因擴增，并將兩種方法檢測ESBLs的結(jié)果與PCR法藥敏結(jié)果進行對照分析，以評價兩種不同方法在檢測銅綠假單胞菌產(chǎn)ESBLs的正確性。 4.對192株多重耐藥的銅綠假單胞菌臨床分離

3、株進行第Ⅰ類整合酶和Ⅰ類整合子相關(guān)基因的PCR擴增檢測，將整合子擴增產(chǎn)物按分子量大小進行分類整理，對其中部分產(chǎn)物進行克隆測序，拼接出全長基因序列后登陸Genebank。 結(jié)果： 1.192株多重耐藥的PA中以呼吸科分布最多，占41%，其次為ICU、燒傷科、血液科、外科及其它科室，分別為26%、17%、15%、6%和2%；各種臨床標本中以痰液中多重耐藥的PA分離率最高，占60%，其次為燒傷創(chuàng)面38%，膿液11%，咽拭子4%

4、，引流液3%，血液2%。 2.微量肉湯稀釋法顯示，該192株多重耐藥的PA對亞胺培南和美洛培南的耐藥性非常嚴重，其MIC值大于8μg/ml者分別為95.3%和94.8%；改進的紙片協(xié)同法共檢測出67株金屬β內(nèi)酰胺酶陽性株，根據(jù)其與底物及抑酶劑間協(xié)同環(huán)的類型共分為4種不同表型；PCR方法共擴增出65株金屬β內(nèi)酰胺酶陽性，其中IMP型44株，VIM型21株，該65株P(guān)A中有3株同時伴oprD2基因缺失，其余127株未擴增出IMP和V

5、IM基因，但有14株oprD2基因缺失。 3.按CLSI推薦的ESBLs表型檢測方法對192株多重耐藥的PA進行ESBLs檢測，其中6株ESBLs表型檢測結(jié)果陽性，占總菌株數(shù)的3.1%：用PCR方法對PA的染色體DNA和質(zhì)粒DNA分別進行ESBLs相關(guān)的基因檢測，共檢測出123株TEM基因陽性，占64.1%（123/192），10株SHV基因陽性，占5.2%（10/192），ESBLs總陽性率為69.3%（133/192），在質(zhì)

6、粒DNA和染色體DNA中均有ESBLs的基因分布；與K-B法藥敏結(jié)果統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，CLSI推薦的ESBLs表型檢測結(jié)果與PA的耐藥表型符合率較低而PCR方法檢測結(jié)果與PA的耐藥表型符合率較高，兩種方法的檢測結(jié)果具有顯著性差異。 4.192株多重耐藥的PA進行第Ⅰ類整合酶基因擴增，共有106株陽性，陽性率為55.2%；對第Ⅰ類整合子相關(guān)的基因進行PCR擴增檢測，共有98株測得整合子相關(guān)基因組，陽性率為51.0%，產(chǎn)物大小從800b

7、p至6000bp左右不等，根據(jù)其電泳圖譜可分為11種不同型別：部分PA中同時存在兩種或兩種以上的不同分子量大小的第Ⅰ類整合子，部分位于質(zhì)粒DNA，部分位于染色體DNA，部分在質(zhì)粒DNA和染色體DNA中共存；對部分菌株的整合子擴增產(chǎn)物測序發(fā)現(xiàn)第Ⅰ類整合子中多攜帶1～3種不同的耐藥基因盒，其中以aacA4基因分布最為廣泛，另有VIM-2、aadB、pse-1、arr-3等功能基因組分布于Ⅰ類整合子中。 結(jié)論： 1.我院多重耐

8、藥的PA在各臨床科室分布廣泛，以ICU分離率最高；各種臨床標本中，以痰液的分離率最高。 2.銅綠假單胞菌對抗菌藥物具有多重耐藥性，其耐藥機制與產(chǎn)生金屬β-內(nèi)酰胺酶密切相關(guān)；改進的紙片協(xié)同法對篩選PA臨床分離株產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的檢測具有良好的應(yīng)用前景。 3.ESBLs在銅綠假單胞菌中檢出率高，是導(dǎo)致三代頭孢菌素耐藥的主要原因；CLSI推薦的ESBLs表型確證試驗不適合PA產(chǎn)ESBLs的表型檢測，PCR方法對PA產(chǎn)ESBL