皮質(zhì)類固醇激素對鼻息肉組織MUC8表達的影響.pdf

1、浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文皮質(zhì)類固醇激素對鼻息肉組織MUC8表達的影響姓名：汪際云申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：耳鼻咽喉科學(xué)指導(dǎo)教師：楊蓓蓓20040501浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文局部皮質(zhì)類固醇激素噴劑。另1 8 例術(shù)前一個月無類固醇激素用藥史( 包括鼻腔局部噴用和全身應(yīng)用) ，作為對照，男性1 4 例，女性4 例。年齡1 4 ～5 8 歲，平均年齡3 8 ．3 ±1 5 ．2 歲。臨床分期，I I 型l 期4 例，I I 型2 期9 例，I

2、 【型3 期4 例，U I 型1 例。兩組病例均在鼻內(nèi)鏡手術(shù)時，取鼻息肉標(biāo)本，經(jīng)生理鹽水漂洗，去除血跡后，立即裝入E p p e n d o f 管，置于一8 0 “ C 冰箱貯藏備測。2 ．實驗方法R N A 提?。罕鶅霰窍⑷饨M織約5 0 ～1 0 0 m g 液氮中碾碎后與I m l T r i z o l 試劑混勻，加O ．2 m l 氯仿，用力振蕩，4 ℃1 2 0 0 0r p m 離心1 5 分鐘。再加異丙酵沉淀R N A

3、。7 5 ％乙醇漂洗，D E P C 水溶解。e D N A 的合成：取8 ug 總R N A 樣品，7 0 。C 水浴5 m i n ，立即冰浴冷卻，依次加入5×逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液5 u I ，1 0 m Md N T P s l ．2 5p l ，5 0 p m o l O l i g d T 引物lp i ，2 0 0 U ／u i逆轉(zhuǎn)錄酶( M o l o n e ym u r i n el e u k e m i a

4、v i r u s ，M ．M L V ) 1 u I ，4 0 U ／u I R n a s i n O ．6 5ul 。最后加D E P C 水至總體積2 5 uI 。4 2 “ C 溫浴6 0 m i n ，9 5 ‘C 水浴5 m i n 滅活M ．M L V 酶，得到c D N A 。聚合酶鏈反應(yīng)( P o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ，P C R )M U C 8 e D

5、 N A 擴增：以上述c D N A 為模板，用M U C 8 引物進行P C R ，循環(huán)3 5 個周期。引物根據(jù)基因庫報導(dǎo)M U C 8m R N A 序列( G e n e b a n k a c c e s s i o nn u m b e rU 1 4 3 8 3 ) 設(shè)計如下：上游鏈 5 ’- A C A G G G T T T C T C C T C A T T G ．3 ’；下游鏈 5 ’．C G T T T A T T

6、C C A G C A C T G T T C ．3 ’。內(nèi)參照B —肌動蛋白( p - a c t i n ) c D N A 擴增；同樣以上述e D N A 為模板，以B ．a(chǎn) c t i n引物進行P C R 。引物序列：上游鏈5 ’．T T ℃C A G C C T T c c l v I ℃c T G G G ．3 ’；下游鏈5 ’．T T G C G C T C A G G A G G A G C A A T ．3 ’。P

7、C R 反應(yīng)條件均為9 4 ℃預(yù)變性5r a i n ，9 4 “ 0 變性3 0 s ，5 5 6 C 退火3 0 s ，7 2 4 C 延伸3 0s ，循環(huán)3 5 個周期。然后7 2 4 C 延伸1 0 m i n 。P C R 產(chǎn)物定量取1 0 ul P C R 產(chǎn)物，2 ％瓊脂糖凝膠電泳，用數(shù)字成像系統(tǒng)進行陽性條帶的密度掃描，記錄掃描值。根據(jù)掃描值計算m R N A 指數(shù)( R I ) ：R 1 2 M U C 8 m R N