胚胎氨基酸代謝與胚胎發(fā)育潛能的關(guān)系研究.pdf

1、研究背景:
　　世界首例試管嬰兒于1978年出生，自此后體外受精—胚胎移植(IVF—ET)技術(shù)已在世界范圍內(nèi)普遍開展，盡管其應(yīng)用廣泛，但低成功率和高多胎妊娠率仍然是目前人們難以應(yīng)對的難題。據(jù)最近的輔助生殖協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，在輔助生殖技術(shù)(ART)中多胎率達(dá)到40％。多胎妊娠導(dǎo)致較高的母嬰并發(fā)癥，比如早產(chǎn)、胎膜早破、產(chǎn)前出血、妊高癥等，威脅母嬰安全。近幾年，ART安全性日益得到重視，很多國家開始限制移植入宮腔的胚胎個(gè)數(shù)。美國生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)建議

2、，對超排卵有足夠反應(yīng)的婦女一次移植胚胎數(shù)不超過2個(gè)，以減少多胎妊娠的發(fā)生率。
　　移植多個(gè)胚胎是ART中多胎妊娠最主要的原因。單胚胎移植是降低多胎妊娠率的一種有效方法。歐洲已有不少學(xué)者對選擇性單胚胎移植進(jìn)行了嘗試。我國也有中心對單胚胎移植的妊娠結(jié)局及可行性進(jìn)行探討，認(rèn)為IVF-ET周期選擇取卵后第三天的優(yōu)質(zhì)胚胎或囊胚期行單胚胎移植，可達(dá)到相對較高的妊娠率并減少多胎妊娠的發(fā)生。但是由于缺乏評估胚胎發(fā)育活力的有效方法，所以進(jìn)行單胚胎移

3、植會(huì)遇到來自醫(yī)生和患者兩方面的壓力。
　　卵裂期胚胎發(fā)育潛能的評估是保證人類輔助生殖技術(shù)成功率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但是目前廣泛采用的判斷胚胎發(fā)育潛能的唯一方法是形態(tài)學(xué)評估的方法。形態(tài)學(xué)評估無損傷性，但是這種方法具有一定的局限性，常常會(huì)發(fā)現(xiàn)形態(tài)學(xué)評分與胚胎后續(xù)的發(fā)育情況不符合。進(jìn)行囊胚培養(yǎng)也是評價(jià)胚胎發(fā)育潛能，篩選胚胎的有效手段，但是由于卵裂期胚胎能夠發(fā)育到囊胚的比例尚不理想，進(jìn)行囊胚培養(yǎng)有可能失去移植機(jī)會(huì)，所以絕大多數(shù)中心仍然采用卵裂期胚

4、胎移植。
　　為此研究者進(jìn)行了大量研究。有學(xué)者認(rèn)為，胚胎代謝分析可能會(huì)有效地選擇優(yōu)質(zhì)胚胎。但是到目前為止，也還沒有任何一種胚胎代謝參數(shù)被常規(guī)應(yīng)用于臨床作為選擇優(yōu)質(zhì)胚胎的依據(jù)。如何準(zhǔn)確預(yù)測早期胚胎的發(fā)育潛能，減少移植胚胎數(shù)目，改善胚胎種植率和臨床妊娠率，同時(shí)又減少多胎妊娠，是ART的巨大挑戰(zhàn)，尚需深入研究。
　　胚胎代謝研究中常用的指標(biāo)包括氨基酸、葡萄糖、丙酮酸的代謝情況，另外還有胚胎呼吸率、可溶性人白細(xì)胞抗原G、血小板活性因

5、子、甚至瘦素等。近年的研究表明，氨基酸是胚胎培養(yǎng)過程中重要的調(diào)控因子。除充當(dāng)細(xì)胞內(nèi)生物合成的原料外，還參與碳水化合物代謝、滲透壓以及細(xì)胞內(nèi)pH值的調(diào)節(jié)等。氨基酸不但有利于維持細(xì)胞正常功能，而且能促進(jìn)胚胎發(fā)育和分化，提高種植后胚胎的發(fā)育潛能。
　　以往的研究中曾有報(bào)道部分種類的氨基酸可預(yù)測囊胚形成以及臨床妊娠率及活產(chǎn)率。由于氨基酸在培養(yǎng)液中含量很低，因此方法學(xué)上采用HPLC的方法，但是由于檢測耗時(shí)、費(fèi)用高且對技術(shù)要求較高，難以實(shí)現(xiàn)臨

6、床應(yīng)用。近年來出現(xiàn)的HPLC-MS技術(shù)能夠快速檢測微量樣本中多種氨基酸的含量，為氨基酸代謝應(yīng)用于胚胎選擇帶來了新的機(jī)會(huì)。
　　研究目的:
　　1.通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，初步了解胚胎的氨基酸代謝與胚胎質(zhì)量的關(guān)系。
　　2.通過人類胚胎的氨基酸代謝情況，進(jìn)一步了解人類胚胎氨基酸代謝與囊胚形成的關(guān)系。
　　3.通過對人類囊胚形態(tài)參數(shù)的分析，來評估氨基酸代謝與囊胚質(zhì)量的關(guān)系。
　　研究方法:
　　1.動(dòng)物試驗(yàn)部分

7、r>　　a)對ICR品系的小鼠進(jìn)行超促排卵，在受孕后2細(xì)胞階段時(shí)處死小鼠，獲取2細(xì)胞階段的胚胎，每個(gè)胚胎在一個(gè)液滴內(nèi)進(jìn)行體外培養(yǎng)。
　　b)在鼠胚的卵裂期階段將胚胎移入囊胚培養(yǎng)液，收集廢棄的卵裂期培養(yǎng)液，以及空白對照培養(yǎng)液，采用HPLC-MS測定樣本中30種氨基酸的濃度。
　　c)將形成囊胚的小鼠胚胎進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧?，?jì)數(shù)ICM和TE的細(xì)胞數(shù)，以此代表囊胚的質(zhì)量。
　　d)分析卵裂期培養(yǎng)液中氨基酸濃度的變化率與ICM和

8、TE計(jì)數(shù)的關(guān)-系。
　　e)將小鼠胚胎卵裂期的培養(yǎng)液內(nèi)氨基酸濃度減去空白培養(yǎng)液的氨基酸濃度，用兩者之差除以相應(yīng)空白培養(yǎng)液的濃度之后，得到該氨基酸濃度的變化率。篩選出變化率較大的幾種氨基酸，用其濃度的變化率分別與囊胚的ICM細(xì)胞數(shù)和TE細(xì)胞數(shù)進(jìn)行多元逐步回歸分析。
　　2.人類胚胎的實(shí)驗(yàn)部分
　　a)選擇年齡介于25～35歲初次治療因雙側(cè)輸卵管不通進(jìn)行體外受精治療的患者。
　　b)受精后胚胎進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)液滴(20

9、ul)一個(gè)胚胎，移植后剩余的胚胎在卵裂期后轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，仍然為每液滴一個(gè)胚胎單獨(dú)培養(yǎng)。
　　c)收集患者的卵裂期培養(yǎng)液，并采用HPLC-MS的方法進(jìn)行氨基酸濃度的測定。
　　d)觀察患者胚胎后續(xù)囊胚形成情況，并對形成的囊胚進(jìn)行圖像采集和形態(tài)參數(shù)的測量，包括:沿透明帶圓周分布的TE細(xì)胞數(shù)、ICM的面積。用這兩個(gè)參數(shù)代表人類囊胚的質(zhì)量。
　　e)每枚胚胎的培養(yǎng)液檢測了30種氨基酸的濃度及10份相同條件下的空白液

10、的培養(yǎng)液的濃度。用培養(yǎng)液中氨基酸濃度減去空白液中的同種氨基酸的濃度得出的差值的絕對值除以空白液的氨基酸濃度，得出氨基酸變化率。
　　f)采用logistic回歸的方法分析氨基酸濃度變化率與囊胚形成之間的關(guān)系。
　　g)采用多元逐步回歸的方法分別分析氨基酸變化率與囊胚的ICM細(xì)胞數(shù)和TE細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系。
　　研究結(jié)果:
　　1.動(dòng)物試驗(yàn)部分:
　　a)15只ICR雌鼠，經(jīng)過超促排卵后，共獲得503枚2細(xì)胞階

11、段的胚胎。每枚胚胎置入一個(gè)20ul的液滴中進(jìn)行單胚胎培養(yǎng)，培養(yǎng)之后形成孵化期囊胚428枚，囊胚形成率為85.1％。
　　b)經(jīng)過胚胎培養(yǎng)后形成的孵化期小鼠囊胚均進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧?。染色后在熒光顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)ICM和TE的細(xì)胞數(shù)。
　　c)平均每枚胚胎的ICM細(xì)胞數(shù)21.92±4.23;平均每枚胚胎的TE細(xì)胞數(shù)83.69±18.96。
　　d)經(jīng)多元逐步回歸分析，結(jié)果提示，谷氨酰胺的濃度變化率與TE的細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)。差

12、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其余氨基酸濃度與孵化期囊胚的質(zhì)量的兩種參數(shù)間無明顯相關(guān)性。
　　2.人類胚胎實(shí)驗(yàn)部分:
　　a)共收集14例患者受精后的胚胎，胚胎在卵裂期培養(yǎng)液滴內(nèi)培養(yǎng)，每個(gè)液滴內(nèi)放置一枚胚胎，取卵后第3天移植2枚胚胎后剩余胚胎轉(zhuǎn)移入囊胚培養(yǎng)液滴，仍為每液滴一枚胚胎。檢測廢棄的卵裂期培養(yǎng)液滴內(nèi)的30種氨基酸濃度。
　　b)這67枚卵裂期胚胎繼續(xù)囊胚培養(yǎng)后形成擴(kuò)張期囊胚29枚。囊胚形成率為43.2％。

13、r>　　c)對囊胚進(jìn)行了圖象采集后，進(jìn)行形態(tài)學(xué)參數(shù)的測量。ICM面積平均為3637.79±3254.68 um2，在圓周上分布的TE細(xì)胞數(shù)平均為7.8±2.6個(gè)。
　　d)將囊胚形成與否和卵裂期培養(yǎng)液內(nèi)氨基酸濃度變化率進(jìn)行Logistic回歸分析。結(jié)果提示天門冬酰胺(Asn)的變化率對囊胚形成有最明顯的影響，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對囊胚形成的預(yù)測作用由56.7％上升到70.1％。
　　e)采用多元線性逐步回歸分析發(fā)現(xiàn)，Asn的變化率

14、與TE細(xì)胞數(shù)之間有最大的相關(guān)性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而對于囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的面積，最有相關(guān)性的氨基酸為Ala。
　　研究結(jié)論:
　　1.米用HPLC-MS檢測氨基酸濃度的方法來評價(jià)胚胎發(fā)育潛能，結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，檢測速度快，能夠在胚胎移植當(dāng)日得到檢測結(jié)果，對正常的體外受精-胚胎移植治療流程無影響，有應(yīng)用于臨床的可能性。
　　2.小鼠卵裂期胚胎的谷氨酰胺變化率與囊胚的形態(tài)學(xué)質(zhì)量有關(guān)。
　　3.人類卵裂期胚胎氨基酸變化率