從Toll樣受體通路探討加味桔梗湯治療內(nèi)毒素致急性肺損傷的作用機(jī)制.pdf

1、急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是指由心源性以外的各種肺內(nèi)、外致病因素所導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性、缺氧性呼吸衰竭。其發(fā)病機(jī)理錯(cuò)綜復(fù)雜，迄今尚未完全闡明，亦無滿意的治療措施，病死率高達(dá)50％。根據(jù)其臨床表現(xiàn)，ALI當(dāng)屬中醫(yī)學(xué)“肺熱證”、“喘證”、“結(jié)胸”等范疇。近年來，中醫(yī)藥工作者結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對ALI發(fā)病機(jī)制的研究新進(jìn)展，采用辨病與辨證相結(jié)合，從熱毒論治ALI，雖取得了一定療效，但并未顯著降低其死亡率；因此，深入研究AL

2、I的中醫(yī)發(fā)病機(jī)制并在其指導(dǎo)下尋找有效方藥，是其治療研究中的新途徑和優(yōu)勢所在。 有資料表明，引發(fā)ALI的致病菌中，G<'->占檢出病菌的70％～80％，內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是G<'->的主要抗原性及致病性成分，而 Toll樣受體4(toll-1ikereceptor 4,TLR4)是LPS的跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，因此，TLR4介導(dǎo)的LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在ALI發(fā)生發(fā)展過程中的應(yīng)起重要作用。這一理論

3、亦體現(xiàn)了從治“人的病”到治“病的人”的治療策略的轉(zhuǎn)變，提示我們應(yīng)重視中醫(yī)肺生理病理與ALI發(fā)病之間的關(guān)系?；谝陨险J(rèn)識，本課題提出肺失宣降、邪毒壅肺、氣機(jī)逆亂是ALI的中醫(yī)發(fā)病機(jī)制，而宣肺解毒法順應(yīng)肺之生理、契合病機(jī)是ALI早期階段的基本治療原則，以此為指導(dǎo)思想的加味桔梗湯亦有望是治療ALI的有效方藥。 目的 1．探討TLR4介導(dǎo)的LPs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在ALI發(fā)生發(fā)展中的作用； 2．闡釋中醫(yī)肺生理病理與ALI發(fā)病之

4、間的關(guān)系，揭示肺臧象理論及ALI相關(guān)病機(jī)的現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)； 3．探討“宣肺解毒”治療早期ALI的可行性及科學(xué)性； 4．從整體、細(xì)胞、分子水平闡明加味桔梗湯治療LPs致ALI的作用機(jī)制，為臨床防治ALI提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 1 理論研究 基于中醫(yī)肺臧象理論與ALI發(fā)病之間的關(guān)系及仲景宣肺法證治概要，從理論上探討“宣肺解毒”治療早期ALI的科學(xué)性和可行性，并進(jìn)一步闡釋加味桔梗湯治療ALl的理論依據(jù)。

5、 2 實(shí)驗(yàn)研究 2.1 加味桔梗湯治療LPs致急性腫損傷大鼠的藥效學(xué)研究 健康雄性SD大鼠90只，隨機(jī)分為正常組(9只)、模型組(27只)、清熱解毒組(27只)、宣腫解毒組(27只)。清熱解毒組灌服黃芩清腫飲(由黃芩、梔子等組成)，宣肺解毒組灌服加味桔梗湯(由桔梗、生甘草、黃芩、梔子等組成)，其余兩組灌服生理鹽水，共6天。第7天，除正常組外，其余各組一次性股靜脈注射LPS(4.9mg/kg)，正常組一次性股靜脈注射

6、等量的生理鹽水，觀察并記錄各組大鼠癥狀體征改變。除正常組外，其余三組動物于造模后2h、4h和6h隨機(jī)分三批處死，其中3只麻醉后，用4％多聚甲醛經(jīng)右心室灌洗后固定，制成光鏡標(biāo)本；6只麻醉后，快速開胸取肺，稱重后投入液氮速凍。通過檢測肺系數(shù)、肺含水量、肺組織勻漿髓過氧化物酶含量等來評價(jià)黃芩清肺飲及加味桔梗湯對LPS致急性肺損傷大鼠的治療作用。 2.2 加味桔梗湯治療LPS致急性肺損傷的機(jī)制研究 分組及造模方法等均同藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

7、。用生化法測定肺組織勻漿SOD、MDA及血清NO、NOS、iNOS的含量；用雙抗體夾心-酶聯(lián)免疫吸附(ABC-ELISA)法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6、及IL-10的含量；用Western-blot及免疫組織化學(xué)法測定肺組織NF—kB的蛋白表達(dá)；用RT-PCR法測定肺組織TLR4 mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 1 理論研究 ALI的發(fā)生發(fā)展與中醫(yī)肺之生理病理密切相關(guān)：ALI病位在肺；邪毒襲肺、肺失宣降是A

8、LI發(fā)生的病理基礎(chǔ)；正邪交爭、內(nèi)生之毒續(xù)生，毒邪壅肺、氣機(jī)逆亂是ALI加重的病理環(huán)節(jié)；治節(jié)失司、肺不主氣是ALI轉(zhuǎn)危之關(guān)鍵；宣肺解毒是ALl早期階段的重要治療原則；以宣肺解毒法為指導(dǎo)思想的加味桔梗湯順應(yīng)肺臧生理、契合病機(jī)，可有效改善ALI時(shí)肺臟功能失調(diào)。 2 實(shí)驗(yàn)研究 通過以上實(shí)驗(yàn)得到以下結(jié)果： 1．中性粒細(xì)胞于肺內(nèi)“扣押”是LPS致急性肺損傷的啟動及進(jìn)行階段中的早發(fā)事件，其引起的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞廣泛

9、損傷是導(dǎo)致肺通透性增加，肺水腫及微血栓形成的關(guān)鍵所在； 2．LPS致急性肺損傷發(fā)生發(fā)展過程中存在氧化/抗氧化平衡紊亂； 3．LPS致急性肺損傷發(fā)生發(fā)展過程中存在致炎反應(yīng)/抗炎反應(yīng)平衡紊亂：TNF—α、IL-1β大量、快速表達(dá)是單核巨噬細(xì)胞活化的分子標(biāo)志；IL—10在ALI早期的高表達(dá)預(yù)示著機(jī)體的免疫功能紊亂； 4．LPS致急性肺損傷時(shí)，存在NF-kB由細(xì)胞漿向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移，其激活在LPS致急性腫損傷發(fā)病中起核心作

10、用； 5．Toll樣受體不僅是抵抗外邪侵襲的第一道防線，而且是機(jī)體先天免疫與繼發(fā)免疫之間的橋梁。ALI時(shí)，肺組織TLR4 mRNA的大量表達(dá)是加重ALI的病理過程中急性炎癥反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的重要扳機(jī)點(diǎn)之一； 6．以宣肺解毒為指導(dǎo)思想的加味桔梗湯治療LPs致急性肺損傷的機(jī)制主要為： (1)減少中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)的黏附和聚集，從而減少其對腫組織的浸潤； (2)促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生抗氧化因子，提高機(jī)體對氧自山基的清除能力，調(diào)節(jié)氧

11、化/抗氧化平衡； (3)顯著降低LPS致急性肺損傷大鼠血清中致炎因子TNF—α、IL-1β及抗炎因子IL-10的含量； (4)抑制LPS致急性肺損傷肺組織NF-kB p65由胞漿向胞核轉(zhuǎn)移，阻斷眾多炎性因子的表達(dá)； (5)抑制LPS致急性肺損傷大鼠肺組織TLR4 mRNA基因表達(dá)，調(diào)控NF-kB等轉(zhuǎn)錄因子的激活。 結(jié)論 綜合理論及實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，得出以下結(jié)論： 1 宣肺解毒治療早期ALI的可

12、行性及科學(xué)性基于中醫(yī)肺藏象理論與ALI發(fā)病之間的關(guān)系，認(rèn)為ALI病位在肺，病機(jī)關(guān)鍵是邪毒犯肺、肺失宣降；而全身氣血津液運(yùn)行輸布障礙，熱、瘀、毒、水(或痰、濕、飲)等病理產(chǎn)物驟生，壅阻肺絡(luò)、氣機(jī)逆亂是其發(fā)展加重的核心環(huán)節(jié)；正虛邪盛、治節(jié)失司、肺不主氣是ALI轉(zhuǎn)危之關(guān)鍵。這一中醫(yī)學(xué)發(fā)病機(jī)制提示肺生理功能在ALl發(fā)生發(fā)展中起重要作用，并啟發(fā)了治療ALI早期階段的根本原則——宣肺解毒?？傊?，從理論上講，早期宣肺解毒的治療原則不但突破了過于強(qiáng)調(diào)熱

13、毒致病的傳統(tǒng)理論，而且是仲景治療肺系疾病時(shí)重在宣肺祛邪這一指導(dǎo)思想的繼承和發(fā)揚(yáng)。 2 中醫(yī)學(xué)肺藏象理論與ALl相關(guān)病理環(huán)節(jié)的現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)ALI發(fā)病過程中伴氧自由基大量生成、炎癥因子的過度表達(dá)、細(xì)胞凋亡等多種病理反應(yīng)，其復(fù)雜性表明，LPS致急性肺損傷存在多種病理環(huán)節(jié)，臨床應(yīng)采用綜合療法，多靶點(diǎn)治療原則。因此，深入系統(tǒng)研究TLR4介導(dǎo)的內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不但為臨床控制急性肺損傷時(shí)瀑鏈?zhǔn)窖装Y反應(yīng)提供切入點(diǎn)，而且部分揭示了中醫(yī)學(xué)肺衛(wèi)相

14、關(guān)、毒邪致病及肺主治節(jié)等宏觀理論與Toll樣受體通路這一微觀層次的病理機(jī)制之間的生物學(xué)基礎(chǔ)，構(gòu)建了ALI發(fā)病宏觀病機(jī)與微觀病機(jī)之間的橋梁。 3 加味桔梗湯治療LPS致急性肺損傷的藥理學(xué)機(jī)制肺失宣降、邪毒壅肺、氣機(jī)逆亂是ALI的核心病理環(huán)節(jié)，而邪毒是導(dǎo)致ALI損傷的重要因素。因此，在ALI早期，應(yīng)宣肺解毒、截?cái)嗖〕蹋恍我越舛?，解毒以宣肺，恢?fù)肺臟生理功能。另外，復(fù)方中藥配伍的協(xié)同作用可體現(xiàn)在不同病理環(huán)節(jié)、不同靶點(diǎn)生物學(xué)效應(yīng)等方面