應用siRNA特異沉默EBV潛伏期基因EBNA2表達的初步研究.pdf

1、EBNA2是EBV感染宿主細胞后最先表達的病毒基因產(chǎn)物之一，由BYRF1基因編碼，與細胞內(nèi)蛋白無任何明顯的同源序列。EBNA2是一種病毒轉(zhuǎn)錄因子，不能直接與DNA結(jié)合，但可通過與細胞抑制重組信號結(jié)合蛋白RBP-J k及其它一些胞內(nèi)DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合間接作用于EBNA2反應啟動子。EBNA2具有核定位序列、DNA結(jié)合部位及轉(zhuǎn)錄激活部位等功能區(qū)域，是首個被確定與病毒細胞轉(zhuǎn)化功能有密切關系的病毒蛋白。EBNA2缺失的EBV毒株P3-HR1失

2、去轉(zhuǎn)化B細胞的能力，提示我們可以通過干擾EBNA2的表達影響其轉(zhuǎn)化細胞的能力。同時作為EBV BYRF1基因特異性表達的產(chǎn)物，EBNA2可以反映EBV的存在情況以及在細胞內(nèi)的拷貝數(shù)。 RNAi是由雙鏈RNA介導的遺傳干擾現(xiàn)象，能夠特異、有效地降解mRNA，引起轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默；研究表明，21-23nt的小干擾RNA(small interferenceRNA，siRNA)可介導哺乳動物細胞特定基因的沉默。RNAi具有高效性和

3、高度特異性，可能成為封閉基因的新技術而在基因功能研究和疾病基因治療中發(fā)揮重要作用。大量研究結(jié)果證實，siRNA可以有效抑制所有內(nèi)源性基因的mRNA從而敲除該基因的功能，目前siRNA己經(jīng)成為敲除特定基因在哺乳動物細胞系中表達的強大工具。 本研究中我們化學合成了靶向EBNA2編碼基因的特異性siRNA，采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染EBVⅢ型潛伏的胃癌上皮細胞GT38，觀察分析siRNA對EBNA2基因表達的抑制作用以及靶基因沉默對GT38細胞

4、的影響。同時構(gòu)建能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生靶向EBNA2編碼基因的siRNA的psuPER逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，進而篩選出穩(wěn)定產(chǎn)毒的細胞克隆，以觀察比較兩種干涉方式對目的基因表達的抑制效果以及對靶細胞的影響。 第一部分化學合成siRNA對GT38細胞EBNA2基因表達的抑制作用目的采用化學合成法合成針對EBNA2編碼基因的siRNA，分別轉(zhuǎn)染EBV陽性腫瘤細胞GT38細胞，觀察人工合成siRNA對EBNA2的特異沉默效果以及EBNA2特異性沉默對EB

5、V陽性腫瘤細胞的影響。 方法 ①化學合成3組靶向EBNA2編碼基因的siRNA，以EBVⅢ型潛伏的胃癌上皮細胞GT38為靶細胞，采用脂質(zhì)體法分別將3組siRNA轉(zhuǎn)染GT38細胞，同時設脂質(zhì)體對照和細胞對照。②采用RT-PCR檢測靶基因EBNA2 mRNA的轉(zhuǎn)錄表達水平，并篩選出最佳轉(zhuǎn)染濃度及抑制效果最為理想的siRNA鏈。③將抑制效果最好的siRNA鏈以最佳轉(zhuǎn)染濃度轉(zhuǎn)染靶細胞，采用Hoechst 33258、透射電鏡和流

6、式細胞術檢測 GT38細胞周期和凋亡的變化。 結(jié)果 ①RT-PCR檢測結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)染siRNA的細胞對照相比，siRNA789、siRNA764和siRNA257對GT38細胞EBNA2的表達均具有明顯的抑制作用(P<0.01)，其中以siRNA789的抑制作用更強；②與未轉(zhuǎn)染的細胞對照比較，轉(zhuǎn)染sirNA789后48h和72h GT38細胞中EBNA2 mRNA表達水平明顯下降，兩兩間比較均有顯著性差異(P<0.0

7、1)，而siRNA789轉(zhuǎn)染后24h抑制效果不明顯(P>0.05)；③在0～50nM濃度范圍內(nèi)siRNA789轉(zhuǎn)染72h后EBNA2 mRNA轉(zhuǎn)錄表達水平隨濃度增加而逐漸降低，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；當siRNA作用濃度為50nM～100nM siRNA各組間差別不明顯(P>0.05)，轉(zhuǎn)染非特異siRNA細胞組與細胞對照比較無顯著性差異(P>0.05)；④Hoechst 33258染色和透射電鏡結(jié)果顯示，與對照組比較，實驗

8、組GT38細胞未見胞核濃縮，也未觀察到凋亡小體；流式細胞分析結(jié)果表明，與對照組比較，實驗組細胞未出現(xiàn)凋亡，但其S其細胞數(shù)量明顯減少。 結(jié)論 化學合成siRNA能有效抑制GT38細胞中EBNA2編碼基因的表達，其抑制作用具有時間依賴性，在一定濃度范圍內(nèi)呈明顯的量效關系，且對靶基因的特定序列具有較強的選擇偏向性。化學合成siRNA誘導EBNA2編碼基因沉默后，不能引起靶細胞明顯的凋亡，但可引起靶細胞S期數(shù)量減少。 第

9、二部分特異性沉默BV潛伏期基因EBNA2 pSIJPER retro RNAi系統(tǒng)的構(gòu)建 目的:構(gòu)建能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生靶向EBV核抗原EBNA2編碼基因siRNA的pSUPER逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并篩選出穩(wěn)定產(chǎn)毒的細胞克隆。 方法:采用DNA重組技術將60nt能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生靶向EBNA2小發(fā)夾RNA(smallhairpin RNA，shRNA)的寡核苷酸序列定向克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSUPER.retro.neogfp，并用限制性內(nèi)切

10、酶酶切鑒定以及測序鑒定；脂質(zhì)體法將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染包裝細胞系PA317，G418篩選獲得穩(wěn)定產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的細胞克隆。 結(jié)果:酶切鑒定及測序鑒定結(jié)果表明插入片段的序列和方向完全正確；重組載體轉(zhuǎn)染包裝細胞后可表達綠色熒光蛋白，經(jīng)G4-18篩選獲得可穩(wěn)定產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的抗性細胞克隆；病毒滴度為2.5×10<'5>CFU/ml。 結(jié)論:成功構(gòu)建了能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生靶向EBV核抗原EBNA2編碼基因siRNA的pSUPER逆轉(zhuǎn)錄病