TAK1siRNA基因沉默對RA滑膜細胞ATF2表達的影響.pdf

1、目的：
　　 要求培養(yǎng)滑膜原代細胞,制備良好的轉染劑,然后將轉染液導入滑膜細胞內,抑制人類風濕性關節(jié)炎滑膜細胞TAK1基因,給予體外刺激因素干預,檢測ATF2表達量,為人類風濕性關節(jié)炎的治療及研究提供基礎及依據(jù)。
　　 方法：
　　 人類風濕性關節(jié)炎滑膜細胞體外實驗培養(yǎng),收集病人膝關節(jié)置換術、髖關節(jié)置換術中的類風濕性關節(jié)炎病人病變的類風濕性滑膜組織,采用酶消化法進行體外滑膜細胞的培養(yǎng),在培養(yǎng)類風濕滑膜細胞的過程中

2、,采用n型膠原酶及胰酶對標本進行消化體外培養(yǎng),倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀念及細胞數(shù)量。定制sirNA轉染試劑及轉染誘導劑,制備可靠的特異性siRNA,將培養(yǎng)的類風濕細胞分組,采用體外的方式將轉染劑導入需要檢測的細胞內,抑制TAK1基因,然后給予刺激因素刺激完畢后,利用Elisa檢測轉錄因子ATF2的表達情況。
　　 結果：
　　 該實驗四例患者的滑膜細胞標本均采用體外消化培養(yǎng)法成功培養(yǎng),平均傳代至3～5代,細胞生長狀態(tài)較

3、好,比較穩(wěn)定,大約傳至第7代時細胞生長減慢,出現(xiàn)老化狀態(tài)。免疫組化鑒定滑膜細胞均一地表達Vimetin(>95%)、表明所培養(yǎng)的細胞是滑膜成纖維細胞。設計的4組標本分別是實驗組轉染TAK1siRNA、陽性對照組轉染GAPDHsiRNA、陰性對照組轉染堿基錯配siRNA、未轉染細胞組,給予刺激因素刺激生長,經(jīng)檢測,實驗組與對照組相比轉錄因子ATF2含量有明顯的差異,呈現(xiàn)出組間差異,這表明,通過抑制TAK1可降低ATF2的轉錄活性,并可能進