TAK1siRNA基因沉默對(duì)RA滑膜細(xì)胞ATF2表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　 要求培養(yǎng)滑膜原代細(xì)胞,制備良好的轉(zhuǎn)染劑,然后將轉(zhuǎn)染液導(dǎo)入滑膜細(xì)胞內(nèi),抑制人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞TAK1基因,給予體外刺激因素干預(yù),檢測(cè)ATF2表達(dá)量,為人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療及研究提供基礎(chǔ)及依據(jù)。
　　 方法：
　　 人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)培養(yǎng),收集病人膝關(guān)節(jié)置換術(shù)、髖關(guān)節(jié)置換術(shù)中的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人病變的類風(fēng)濕性滑膜組織,采用酶消化法進(jìn)行體外滑膜細(xì)胞的培養(yǎng),在培養(yǎng)類風(fēng)濕滑膜細(xì)胞的過(guò)程中

2、,采用n型膠原酶及胰酶對(duì)標(biāo)本進(jìn)行消化體外培養(yǎng),倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀念及細(xì)胞數(shù)量。定制sirNA轉(zhuǎn)染試劑及轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)劑,制備可靠的特異性siRNA,將培養(yǎng)的類風(fēng)濕細(xì)胞分組,采用體外的方式將轉(zhuǎn)染劑導(dǎo)入需要檢測(cè)的細(xì)胞內(nèi),抑制TAK1基因,然后給予刺激因素刺激完畢后,利用Elisa檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子ATF2的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 該實(shí)驗(yàn)四例患者的滑膜細(xì)胞標(biāo)本均采用體外消化培養(yǎng)法成功培養(yǎng),平均傳代至3～5代,細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較

3、好,比較穩(wěn)定,大約傳至第7代時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)減慢,出現(xiàn)老化狀態(tài)。免疫組化鑒定滑膜細(xì)胞均一地表達(dá)Vimetin(>95%)、表明所培養(yǎng)的細(xì)胞是滑膜成纖維細(xì)胞。設(shè)計(jì)的4組標(biāo)本分別是實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染TAK1siRNA、陽(yáng)性對(duì)照組轉(zhuǎn)染GAPDHsiRNA、陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染堿基錯(cuò)配siRNA、未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組,給予刺激因素刺激生長(zhǎng),經(jīng)檢測(cè),實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比轉(zhuǎn)錄因子ATF2含量有明顯的差異,呈現(xiàn)出組間差異,這表明,通過(guò)抑制TAK1可降低ATF2的轉(zhuǎn)錄活性,并可能進(jìn)