EB病毒潛伏期膜蛋白LMP2A對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的 構(gòu)建EBV潛伏期膜蛋白LMP2A編碼基因的腺病毒表達(dá)載體，初步探討LMP2A表達(dá)對(duì)靶細(xì)胞SGC-7901的生物學(xué)作用。 方法 RT-PCR擴(kuò)增獲取目的基因LMP2A，采用AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建攜帶目的基因的重組腺病毒載體pAd-2A，脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒pAd-2A轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞包裝重組腺病毒。選擇EBV陰性胃癌細(xì)胞SGC-7901作為靶細(xì)胞，試驗(yàn)分重組腺病毒SGC-2A組，病毒對(duì)照SGC-GFP組和細(xì)胞

2、對(duì)照SGC組3組，采用MTT實(shí)驗(yàn)、透射電鏡觀察、流式細(xì)胞分析、激光共聚焦等技術(shù)檢測(cè)目的基因LMP2A表達(dá)對(duì)靶細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。 結(jié)果 ①限制性酶切、PCR及測(cè)序鑒定證實(shí)，目的基因LMP2A正確插入重組質(zhì)粒，HEK293細(xì)胞成功包裝出具有穩(wěn)定感染性的重組腺病毒，命名為vAd-2A，經(jīng)測(cè)定病毒滴度為3.16×10<'12>pfu/L。②MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：與SGC-GFP組和SGC組比較，SGC-2A組細(xì)胞從接種后第2天

3、起表現(xiàn)出更強(qiáng)的增殖能力。③透射電鏡觀察SGC-2A組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變，而SGC-GFP組和SGC組則出現(xiàn)一系列變化，并可觀察到凋亡小體。④激光共聚焦分析表明，SGC-2A組細(xì)胞幾乎均可觀察到較強(qiáng)的cyclinE熒光信號(hào)；而SGC-GFP組僅部分細(xì)胞可觀察到cyclinE熒光信號(hào)，且較弱；未感染病毒的SGC組細(xì)胞則僅有少量細(xì)胞觀察到熒光。⑤流式細(xì)胞分析感染vAd-2A后48h和72h的SGC-7901細(xì)胞s期的比例明顯高于SGC-