siRNA特異性沉默TLR4基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞株的增殖和凋亡的影響以及機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：siRNA特異性沉默肝癌細(xì)胞株的TLR4基因，以研究TLR4基因沉默后對人肝癌細(xì)胞株的增殖和凋亡的影響，并初步探討其作用機(jī)制。
　　方法：合成 TLR4特異性的 siRNA3對（TLR4-siRNA-1、TLR4-siRNA-2、TLR4-siRNA-3），隨機(jī)siRNA陰性對照1對，F(xiàn)AM標(biāo)記的siRNA陰性對照1對；取適量的FAM標(biāo)記的siRNA和lipo2000，使siRNA：lipo2000的比例為0.5:1、1:1

2、、1.5:1、2:1、2.5:1轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞，篩選出最佳的轉(zhuǎn)染條件；將合成好的siRNA分別轉(zhuǎn)入人肝癌細(xì)胞株HepG2，運(yùn)用RT-PCR和Western blot方法篩選出具有最佳沉默效率的siRNA；用具有最佳沉默效率的TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染HepG2，MTT檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖能力的變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡能力的變化；以Western blot法檢測轉(zhuǎn)染前后TLR4下游通路有關(guān)蛋白（MyD88、TRIF、IRF

3、3、IκBα、p-IκBα、NF-κB、ERK和JNK）的表達(dá)。
　　結(jié)果：用熒光顯微鏡觀察，siRNA：lipo2000比例為1：1時轉(zhuǎn)染效率最高，可達(dá)到（90.48±1.27）％；經(jīng)RT-PCR和Western blot法分析轉(zhuǎn)染前后的TLR4表達(dá)含量，TLR4-siRNA-1和TLR4-siRNA-3均發(fā)揮TLR4基因沉默效應(yīng)，TLR4-siRNA1具有最佳的沉默效率；用具有最佳沉默效率的siRNA-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，將TLR

4、4-siRNA-1轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞，MTT檢測發(fā)現(xiàn)TLR4基因沉默后HepG2細(xì)胞的增殖能力減低，流式檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡增加；Western blot檢測發(fā)現(xiàn)TLR4基因沉默后，其下游的蛋白MyD88，TRIF，IRF3，IκBα，JNK和ERK表達(dá)量減低，而NF-κB和p-IκBα的表達(dá)量增高。
　　結(jié)論：TLR4-siRNA-1沉默 TLR4后，很可能通過抑制 ERK和JNK途徑和激活NF-κB途徑來抑制人肝癌細(xì)胞株 Hep