siRNA特異性沉默高血壓相關(guān)基因FXYD5及其功能研究.pdf

1、目的： 通過(guò)RNA干擾(RNAi)技術(shù)特異性沉默大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(CRL-1444)高血壓相關(guān)基因FXYD5的表達(dá)，探索該基因在高血壓發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法： 設(shè)計(jì)并合成4個(gè)針對(duì)大鼠FXYD5基因的特異性siRNA片段(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4)，以含非特異性編碼序列的siRNA-con為對(duì)照。復(fù)蘇并傳代培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞株(CRL-1444)至5～10代，將

2、上述4個(gè)片段及陰性對(duì)照通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染進(jìn)CRL-1444內(nèi)，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡估算轉(zhuǎn)染效率后經(jīng)RT-PCR初步篩選，siRNA-1、siRNA-2兩組的RNA干擾效率較明顯，用real-time PCR定量檢測(cè)該兩組FXYD5的mRNA表達(dá)水平，進(jìn)而采用CCK-8法檢測(cè)FXYD5基因特異性沉默后對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響，采用劃痕法(Woundhealing法)檢測(cè)FXYD5基因特異性沉默后對(duì)細(xì)胞遷移力的影響以及采用超微量Na+

3、-K+-ATPase測(cè)試盒檢測(cè)FXYD5基因特異性沉默后對(duì)細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase活性的影響。 結(jié)果： 熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示siRNA-1使FXYD5的mRNA表達(dá)與空白對(duì)照組(Blank)相比下降86.71％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004，P<0.01)；siRNA-2使FXYD5的mRNA表達(dá)與空白對(duì)照組(Blank)相比下降90.17％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003，P<0.01)；對(duì)照組si

4、RNA-con與空白對(duì)照組(Blank) FXYD5的mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.996，P>0.01)。CCK-8法結(jié)果顯示siRNA-1、siRNA-2兩組與對(duì)照組間細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯差異(P>0.01)。劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移力結(jié)果顯示siRNA-1和siRNA-2轉(zhuǎn)染組平滑肌細(xì)胞遷移力低于siRNA-con轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，P<0.01)，對(duì)照組siRNA-con與空白對(duì)照組(Blank

5、)平滑肌細(xì)胞遷移力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.932，P>0.01)。Na+-K+-ATPas活性檢測(cè)結(jié)果顯示siRNA-1和siRNA-2轉(zhuǎn)染組平滑肌細(xì)胞Na+-K+-ATPas活性低于siRNA-con轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，P<0.01)，對(duì)照組siRNA-con與空白對(duì)照組(Blank)平滑肌細(xì)胞Na+-K+-ATPas活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017，P>0.01)。 結(jié)論： R