ASIC1a對(duì)黑質(zhì)紋狀體多巴胺遞質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)及其分子機(jī)制.pdf

1、第一部分酸敏感離子通道1a在MES23.5細(xì)胞以及斑馬魚體內(nèi)的表達(dá)和功能
　　目的：酸敏感離子通道（Acid sensing ion channels，ASICs）是一類胞外酸化激活的非電壓門控的陽離子通道。本實(shí)驗(yàn)從基因和蛋白水平檢測(cè)MES23.5細(xì)胞和斑馬魚體內(nèi)ASIC1a的表達(dá)，并研究該通道的功能特性，為初步探討ASIC1a在帕金森病(Parkinson′s disease, PD)發(fā)病中的作用提供動(dòng)物和細(xì)胞模型。
　　

2、方法：體外培養(yǎng)MES23.5細(xì)胞，RT-PCR的方法在mRNA水平檢測(cè)MES23.5細(xì)胞ASIC1a的表達(dá)；Western blotting方法在蛋白水平檢測(cè)ASIC1a的表達(dá)；細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記的方法確定 ASIC1a在MES23.5細(xì)胞上的分布；全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)ASIC1a電流特性；鈣離子成像的方法檢測(cè)MES23.5細(xì)胞上ASIC1a通道的離子通透性。免疫熒光標(biāo)記和整體原位雜交方法觀察ASIC1a通道在斑馬魚體內(nèi)的表達(dá)分布；全細(xì)胞膜片

3、鉗檢測(cè)ASIC1電流特性；行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ASIC1對(duì)斑馬魚視覺功能的影響。
　　結(jié)果：（1）從基因和蛋白水平證實(shí) ASIC1a在MES23.5細(xì)胞上有表達(dá)。ASIC1a主要分布在胞膜和胞漿，與酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）有共表達(dá)。（2） MES23.5細(xì)胞胞外酸化可誘發(fā)出ASICs電流，該電流可被阿米洛利（Amiloride）和ASIC1a特異性抑制劑狼蛛毒素（PcTx1）阻斷。（3）斑馬魚的腦部

4、和眼球存在ASIC1基因和蛋白的表達(dá)，但是未能觀察到與TH的共定位。（4）斑馬魚視網(wǎng)膜視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞上記錄到ASICs電流。（5）阻滯ASIC1會(huì)造成斑馬魚視覺功能障礙。
　　結(jié)論：（1）MES23.5細(xì)胞上存在功能性 ASIC1a的表達(dá)。（2）斑馬魚的視網(wǎng)膜上存在ASIC1的表達(dá)，主要分布在視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)板狀層、內(nèi)核層、外板狀層以及感光細(xì)胞層。阻滯ASIC1的活性能夠降低斑馬魚對(duì)光的敏感性，提示ASIC1可能參與斑馬魚視覺功能

5、的調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)為探討ASIC1a在PD發(fā)病中的作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)以及簡(jiǎn)單易行的模型。
　　第二部分酸敏感離子通道1a對(duì)胞外酸化誘導(dǎo)的多巴胺遞質(zhì)釋放的調(diào)控及其分子機(jī)制
　　目的：研究ASIC1a對(duì)多巴胺遞質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)，探討ASIC1a在PD發(fā)病中的作用機(jī)制，并觀察阻滯ASIC1a能否減輕PD模型中DA神經(jīng)元的損傷。
　　方法：以MPP+誘導(dǎo)的MES23.5細(xì)胞為研究對(duì)象，免疫印跡技術(shù)檢測(cè)MES23.5細(xì)胞 ASIC1a、

6、TH、CaMKII的蛋白表達(dá)變化。全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè) ASIC1a電流大小及電流特性的變化；高效液相色譜法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外DA的水平，計(jì)算DA釋放率[胞外含量/(胞內(nèi)+胞外含量)×100％]。不同濃度PcTx1（0.1nM-10nM）預(yù)處理細(xì)胞1h，加入MPP+（10uM）作用12h后，MTT法測(cè)定各組細(xì)胞的存活率和損傷程度。
　　結(jié)果：(1)在MPP+誘導(dǎo)的MES23.5細(xì)胞模型中，ASIC1a蛋白水平和電流幅度顯著增加。（2）以

7、高鉀刺激作為陽性對(duì)照，胞外酸化可明顯增加MES23.5細(xì)胞DA遞質(zhì)釋放，該作用可被 ASIC1a通道阻斷劑PcTx1抑制。（3）在MPP+誘導(dǎo)的MES23.5細(xì)胞模型中，CaMKII蛋白水平顯著增加；無鈣外液和CaMKII抑制劑KN-93減少酸化引起的DA遞質(zhì)釋放增加。（4）MPP+處理12小時(shí)后，細(xì)胞存活率明顯下降；PcTx1預(yù)處理1h，細(xì)胞存活率顯著上升，與 MPP+組相比有統(tǒng)計(jì)差異。(5) MPP+顯著降低MES23.5細(xì)胞中TH

8、蛋白的表達(dá)；與MPP+組相比，PcTx1（10nM）預(yù)處理1h后，TH蛋白的表達(dá)明顯升高。
　　結(jié)論：組織酸化引起黑質(zhì)DA神經(jīng)元上ASIC1a的激活，增加Ca2+的內(nèi)流，促進(jìn)DA遞質(zhì)釋放；同時(shí)Ca2+內(nèi)流通過激活CaMKII（Ca2+/CaMKII信號(hào)通路），上調(diào)ASICla通道的功能，進(jìn)一步促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，造成胞內(nèi)DA遞質(zhì)減少，最終導(dǎo)致DA遞質(zhì)耗竭、DA神經(jīng)元損傷或凋亡。抑制ASIC1a的活性，可減輕其對(duì)DA神經(jīng)元的毒性，從而