運用肝主疏泄理論防治應激性抑郁癥的基礎研究.pdf

1、抑郁癥是一種常見的精神疾病，其終生患病率高達15％～20％。抑郁癥居高不下的發(fā)病率以及造成的危害，已經(jīng)越來越引起醫(yī)藥衛(wèi)生界的重視。抗抑郁藥物有著潛在的市場需求，中藥抗抑郁新藥的研制開發(fā)才剛剛起步，研究的深度和廣度都有待進一步提高，但市場開發(fā)的潛力是巨大的。 基于單胺策略開發(fā)的抗抑郁劑在臨床上出現(xiàn)療效滯后現(xiàn)象，并且大約有30％左右的重度抑郁癥人群對目前的各型抗抑郁劑沒有反應。由于抑郁癥所涉及的病理因素復雜，存在著許多潛在的抗抑郁治

2、療靶點。大量的動物實驗研究和臨床研究證據(jù)都指引我們要超越單胺能突觸策略去提高抗抑郁劑療效。 另外，基于單胺策略的抗抑郁劑對特定腦區(qū)的NMDA受體適應性改變，即下調(diào)NMDA受體功能，產(chǎn)生類似NMDA受體拮抗劑的作用，可能是其抗抑郁效果的實質。大量動物實驗與臨床研究表明NMDA受體拮抗劑具有抗抑郁效果，拮抗NMDA受體功能可改善重癥病人癥狀，而且比現(xiàn)有的抗抑郁藥發(fā)揮作用更快。由此可見，調(diào)控NMDA受體的抗抑郁策略可能比傳統(tǒng)的單胺策略

3、更具優(yōu)勢。NMDA受體拮抗劑的最大問題就是出現(xiàn)精神病副作用，NMDA受體復合體上有多個調(diào)控位點以及NMDA受體本身的異質性能提供了一些選擇性的藥物作用靶點，針對它們的拮抗劑可以預防興奮性毒性，又不阻斷全部NMDA受體，避免毒副作用的產(chǎn)生。 綜上所述，抗抑郁效果的一個重要特征就是能夠使失常的谷氨酸功能正?；６@種正?；梢酝ㄟ^直接作用于谷氨酸能突觸靶點，或者間接地通過其他神經(jīng)遞質系統(tǒng)如5-HT，NE，GABA間接影響谷氨酸能系統(tǒng)

4、。 本研究團隊在1999年在國內(nèi)首次提出的假說：中醫(yī)肝主疏泄調(diào)暢情志的功能在實現(xiàn)對交感—腎上腺髓質以及下丘腦—垂體—腎上腺皮質系統(tǒng)的整體性調(diào)節(jié)上，還可能存在著一定的具體的中樞神經(jīng)機制(包括相關不同腦區(qū)的定位、定量以及神經(jīng)生理生化及病理改變等)；在作用機理上體現(xiàn)出局部(中樞神經(jīng)機制)與整體(NIM網(wǎng)絡)的有機統(tǒng)一。并以加味四逆散(JWSNS)作為調(diào)肝方藥的代表方，對其調(diào)控機體心理應激反應的機制進行了一系列的研究，初步證實了我們的研

5、究假說。 在此基礎上，本研究以心理應激性損傷所致的抑郁癥為研究切入點，結合抑郁癥最新的病理機制研究進展與我們的前期工作基礎，我們進一步提出假說：肝主疏泄調(diào)暢情志抗抑郁的中樞神經(jīng)機制可能是通過下調(diào)NMDA受體功能，抗興奮性毒性，減輕應激性海馬損傷，保護海馬神經(jīng)元，調(diào)控HPA軸有關。 本研究以心理應激損傷所致抑郁癥為研究對象，結合調(diào)肝治法方藥的作用機理，依據(jù)中醫(yī)方—證一效—臟腑相關性理論，進一步揭示中醫(yī)肝臟象功能的本質以及中

6、醫(yī)“肝主疏泄”理論的科學內(nèi)涵；豐富和創(chuàng)新中醫(yī)臟象和情志致病理論，為系統(tǒng)構建運用中醫(yī)調(diào)肝治法方藥防治心理應激性損傷疾病的理論體系提供科學的依據(jù)。同時也為今后研究中醫(yī)不同臟腑機能以及不同病因致病機理提供思路和方法學的借鑒。 本項目的研究成果將一方面為臨床精神情志疾病的防治提供指導與理論依據(jù)；長期以來，我國在國際抗抑郁藥物市場中缺乏競爭力，根據(jù)現(xiàn)今我國抗抑郁藥的市場格局，國內(nèi)很多醫(yī)藥企業(yè)已把研發(fā)重心主要放在發(fā)展中藥抗抑郁藥方面。目前，

7、中藥抗抑郁新藥的研制開發(fā)才剛剛起步，研究的深度和廣度都有待進一步提高，但市場開發(fā)的潛力是巨大的。本研究成果將對進一步闡明抑郁癥的發(fā)病機理和今后開發(fā)出具有自主知識產(chǎn)權的抗抑郁創(chuàng)新中藥新藥，從而提高我國在國內(nèi)外抗抑郁藥物市場中的競爭力，促進國民經(jīng)濟的發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。 第一部分研究報告第一節(jié)調(diào)肝方藥加味四逆散對慢性輕度不可預見性應激模型體重和糖水消耗的影響采用WillnerP慢性輕度不可預計應激動物模型(CMUS)，并加于修改

8、。SPF級Wista大鼠，雄性，體重180-220g，廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。接受應激處理的組別大鼠單獨放在一間獨立的房間，在21天接受不同應激源的刺激，應激源包括有限制空間1h、45度斜籠7h、濕籠17h(濕籠是200g鋪料倒100ml水，使墊料濕透)、新入侵者(兩籠并籠)23h、持續(xù)光照36h、空瓶1h、禁食禁水23h。大鼠按體重和基礎糖水消耗量分為4組：正常組(不施加任何刺激)、慢性輕度不可預計應激模型組、JWSNS組(每

9、次早上8：30灌胃中藥JWSNS，每次2ml)，MK801組(每次早上8：30腹腔注射MK801，0.2mg/Kg/d)。正常組及慢性應激組每次灌胃等量蒸餾水。其中正常組與其余各組分房飼養(yǎng)。 調(diào)肝方藥——加味四逆散(JWSNS)組成柴胡5g、白芍15g、枳殼6g、枸杞子15g、山梔5g、干地黃18g、石決明30g。藥材由本校第一附屬醫(yī)院藥房提供，經(jīng)藥劑科鑒定均為純正藥材。將中藥制成粗粉，首煎將中藥粗粉置8倍溫水中浸泡0.5h，沸

10、騰后文火煎煮4h，注意均勻攪拌，取汁后經(jīng)三層紗布過濾；第二次和第三次煎煮均分別以6倍水文火煎煮2h，同樣方法取汁，合并三次藥液，置水浴箱內(nèi)濃縮至含生藥1.69g/mL。藥液常溫冷卻后，置4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?經(jīng)過禁食禁水23h后，在整個應激進程的第21天下午15：00-16：00進行糖水消耗實驗，并測量體重。所有數(shù)據(jù)以X+S表示，采用SPSS統(tǒng)計軟件進行t檢驗、方差分析。(下同) 在造模之前各組大鼠的體重無差別(p＞0.

11、05)，糖水偏愛度(p＞0.05)，具有可比性；經(jīng)過21天慢性輕度不可預計應激造模后，模型組、JWSNS組、MK801組體重及增重明顯低于正常組(p＜0.01)，而此三組組間無差異。表明CMS可引起大鼠體重下降，而加減四逆散及MK801對大鼠體重的下降無作用。模型組的糖水偏愛度明顯低于正常組(p＜0.01)，而加減四逆散、MK801組與正常組的糖水偏愛度，三組組間無差異。表明CMUS可引起大鼠糖水偏愛度下降，而加減四逆散及MK801能逆

12、轉CMUS抑郁大鼠的糖水偏愛度的下降。 第二節(jié)調(diào)肝方藥對慢性輕度不可預計應激大鼠海馬神經(jīng)元損傷的保護作用動物分組以及藥物和給藥方法基本與第一節(jié)同。海馬神經(jīng)元凋亡率采用流式細胞儀檢測分析，大鼠離體海馬腦片TTC染色，采用比色法。 第三節(jié)調(diào)肝方藥加味四逆散對慢性輕度不可預計應激大鼠海馬NMDA受體通道的影響動物分組以及藥物和給藥方法基本與第一節(jié)同。大鼠海馬NMDA受體單通道電流記錄與分析，采用膜片鉗細胞貼附式記錄NM

13、DA受體單通道電流。采用陽離子成像系統(tǒng)，應用雙激發(fā)波長比例熒光測量法，檢測海馬神經(jīng)元內(nèi)單個細胞鈣離子濃度。 第四節(jié)調(diào)肝方藥加味四逆散對慢性應激性抑郁癥大鼠海馬NMDA受體亞基表達的影響采用慢性多相應激模型。采用的是慢性多相復合應激模型。慢性多相性應激源包括電擊足底(30V，電流強度1.0mA，每隔1min刺激1次，每次持續(xù)10s，共30次)、冰水游泳(4℃，5min)、夾尾(1min)、禁水(24h)、禁食(24h

14、)、限制(2h)。以上應激刺激每天一種，隨機安排在21天內(nèi)。第22天取材。動物分組與藥物同第一節(jié)。 第三部分綜合討論及研究結論第一節(jié)綜合討論一、調(diào)肝方藥JWSNS抗抑郁行為效應中樞NMDAR是涉及情緒行為、學習記憶等腦功能的關鍵物質，參與多種神經(jīng)和精神疾病的腦內(nèi)病理過程。NMDA受體對一些精神心理藥物很敏感。Kalivas采用放射配體結合實驗發(fā)現(xiàn)NMDA受體在大腦皮質、海馬、紋狀體、杏仁核等部位高密度表達，而這些區(qū)域都被認

15、為是在認知和情緒功能起作用的腦區(qū)。 在束縛、強迫游泳應激中采用C-fos為探針，發(fā)現(xiàn)海馬神經(jīng)元大量激活，而這種激活可以為預先給NMDA受體拮抗劑所抑制，表明了谷氨酸能神經(jīng)遞質的參與。而束縛、強迫游泳應激引起的海馬谷氨酸釋放的增高在應激開始幾分鐘就出現(xiàn)，而持續(xù)時間超過應激持續(xù)時間。 應激后腦內(nèi)NMDA受體的活性和數(shù)量增加與應激性行為障礙密切相關。在應激前給予腦區(qū)灌注NMDA受體阻滯劑能減輕動物的應激性焦慮和抑郁。提示中樞N

16、MDAR在應激所致行為效應的腦機制中可能起著重要的作用。由此可見，慢性應激引起的抑郁癥中NMDA受體起著非常重要的作用，NMDA受體的過度激活與動物抑郁情緒有密切關系。而本研究發(fā)現(xiàn)調(diào)肝方藥JWSNS具有抗抑郁作用，改善抑郁癥動物的“快感缺失”行為效應，該效應可能是通過認為通過調(diào)節(jié)NMDA受體功能介導的。 二、調(diào)肝方藥JWSNS抗海馬神經(jīng)元興奮性毒性，保護海馬神經(jīng)元的作用應激導致海馬損傷的機制之一被認為是糖皮質激素誘導的谷氨酸和C

17、a2+依賴的NMDA受體的興奮性作用。 三、調(diào)肝方藥JWSNS對應激性抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元NMDA受體的作用方式調(diào)肝方藥JWSNS能夠降低抑郁癥海馬神經(jīng)元NMDA受體通道的開放概率，使其開放時間減少，使得NMDA受體通道功能下降，使得NMDA受體通道介導的鈣信號下降，從而起到抵抗海馬神經(jīng)元凋亡，保護海馬神經(jīng)元的作用。 四、調(diào)肝方藥JWSNS對應激性抑郁癥HPA軸的興奮性的影響傳統(tǒng)的觀點認為，HPA軸的興奮，主要與下