去細(xì)胞光氧化交聯(lián)處理的牛頸靜脈光化學(xué)法RGD表面修飾及再內(nèi)皮化的研究.pdf

1、第一部分，目的：探討RGD光化學(xué)偶聯(lián)法修飾去細(xì)胞光氧化牛頸靜脈基質(zhì)的方法，以及修飾的RGD肽在體內(nèi)存留情況。 方法： 1．制備去細(xì)胞、光氧化交聯(lián)的牛頸靜脈基質(zhì)材料，裁減成1×1cm<'2>大小的48個(gè)血管片，隨機(jī)分入12個(gè)組中；將RGD-FITC和光偶合劑SANPAH分別配制成0.12mM、0.6mM、1.2mM和6mM四種濃度的溶液，按照1∶0、1∶1和1∶10的三個(gè)反應(yīng)摩爾比在避光下反應(yīng)2小時(shí)，制成12組反應(yīng)液。每組

2、100μl反應(yīng)液滴加在血管片上，365nm的紫外線照射5分鐘，引發(fā)光化學(xué)偶聯(lián)，將RGD共價(jià)結(jié)合到牛頸靜脈血管片上，震蕩漂洗6小時(shí)，樣品制成快速冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察。通過觀察基質(zhì)材料表面不同濃度、不同摩爾比反應(yīng)接枝后的熒光差別，從而初步推斷出合適的反應(yīng)和結(jié)合濃度。 2．以濃度為0.6mM、反應(yīng)摩爾比為1∶1的FITC-RGD和SANPAH，同法制備表面修飾后的牛頸靜脈血管片(實(shí)驗(yàn)組)，物理吸附RGD的血管片作為對照組，8只S

3、D大鼠隨機(jī)平均分入上述兩組中，將血管片分別植入兩組大鼠下腔靜脈，于術(shù)后5天、10天、15天、20天取出標(biāo)本，進(jìn)行快速冰凍切片，觀察并照相留底，以了解熒光標(biāo)記的RGD是否能經(jīng)受體內(nèi)血流的沖擊和細(xì)胞的吞噬而仍然存在。 結(jié)果：應(yīng)用光偶聯(lián)劑后，血管內(nèi)膜面有一層較強(qiáng)的熒光，隨著RGD和SANPAH的濃度的升高，熒光整體上是越來越強(qiáng)，但是二者的濃度高于0.6mM時(shí)，熒光差別不明顯；相同濃度下當(dāng)二者的反應(yīng)摩爾比為1∶1時(shí)，熒光最強(qiáng)。經(jīng)過光化學(xué)

4、偶聯(lián)后的FITC-RGD肽在體內(nèi)20天仍然存在，只是熒光略有衰減，單純涂覆的RGD組綠色熒光5天即完全消失。 結(jié)論：光偶聯(lián)劑SANPAH能夠?qū)崿F(xiàn)RGD與去細(xì)胞光氧化牛頸靜脈的化學(xué)偶聯(lián)， RGD和SANPAH較為合適的接枝反應(yīng)濃度是0.6mM，反應(yīng)摩爾比是1∶1，光化學(xué)交聯(lián)方法接枝的RGD在體內(nèi)保留時(shí)間至少超過20天，體內(nèi)存留效果良好。 第二部分，目的：探討RGD表面修飾后的牛頸靜脈體內(nèi)和體外促進(jìn)再內(nèi)皮化的情況。

5、方法： 1．體外細(xì)胞黏附生長：牛頸靜脈經(jīng)過去細(xì)胞和光氧化交聯(lián)后，裁成與24孔培養(yǎng)板孔徑相同大小的、直徑1.6cm的血管片，用光偶聯(lián)劑SANPAH采用第一章的方法將RGD接枝到牛頸靜脈血管片上，以未接枝RGD的作為空白對照。在其上面種植人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株細(xì)胞(CRL-2480)5×10<'5>/ml，靜態(tài)培養(yǎng)5天，取1，3，5天標(biāo)本消化血管片表面細(xì)胞并記數(shù)，標(biāo)本切片HE染色，對比RGD接枝后和空白對照組血管片表面細(xì)胞黏附數(shù)目和HE

6、的染色結(jié)果，以探討接枝RGD體外能否促進(jìn)細(xì)胞黏附和生長。 2．再內(nèi)皮化的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：8只SD大鼠平均分入處理組和對照組，將RGD表面修飾和未修飾的血管片植入下腔靜脈，采用連續(xù)縫合的方式進(jìn)行補(bǔ)片，術(shù)后兩組均給予10mg/kg/天劑量的阿托伐他汀喂養(yǎng)，分別于術(shù)后5天、10天、15天、20天取出血管片，標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋、HE染色、掃描電鏡和Ⅷ因子免疫組織化學(xué)檢測，取普通顯微鏡40倍下的HE染色的血管片留底照片，在Image Pro Pl

7、us圖像測量軟件上測量內(nèi)膜厚度，計(jì)算平均值，兩組間進(jìn)行比較。 結(jié)果： 1．體外培養(yǎng)： (1)細(xì)胞記數(shù)：細(xì)胞培養(yǎng)第1、3、5天，RGD組細(xì)胞數(shù)目均多于對照組。 (2)標(biāo)本石蠟包埋后切片HE染色結(jié)果：第1天各組血管片表面細(xì)胞排列密集，紊亂，未完全鋪開；第3天，對照組血管表面細(xì)胞數(shù)量減少明顯，有斷裂出現(xiàn)；RGD組細(xì)胞連接成片，呈單層排布；第5天這種現(xiàn)象更明顯。 2．體內(nèi)實(shí)驗(yàn)： (1)組織大體觀結(jié)

8、果：血管片隆起于下腔靜脈表面，質(zhì)軟，周圍粘連較輕，顏色變白，亞甲蘭的藍(lán)色已完全消失。剖開下腔靜脈后見補(bǔ)片表面光滑，無血栓，縫線清晰可見，其上附著一薄層增厚組織，薄而透明，為新生內(nèi)膜組織。 (2)HE染色結(jié)果：經(jīng)過光氧化交聯(lián)的BJV植入體內(nèi)，細(xì)胞浸潤受到抑制，浸潤全層首先在血管片吻合區(qū)域發(fā)生， 20天兩組中間區(qū)域均未能浸潤全層，只是在小部分個(gè)別區(qū)域全層BJV有細(xì)胞相連；RGD組在新生內(nèi)膜中有更多的細(xì)胞，而對照組則主要還是纖維素等不

9、定型成分。新生內(nèi)膜在吻合區(qū)域薄，中間較厚，剔除新生內(nèi)膜后的HE切片顯示：術(shù)后5天，RGD組BJV表面有細(xì)胞黏附，對照組幾乎沒有細(xì)胞；RGD組5天即能在內(nèi)膜面看到內(nèi)皮樣細(xì)胞覆蓋，10天完整覆蓋補(bǔ)片，對照組則需要20天才能看到內(nèi)膜面較多的細(xì)胞覆蓋。 (3)Ⅷ因子染色結(jié)果：RGD表面修飾后的血管片植入大鼠體內(nèi)5天Ⅷ因子染色即呈陽性，而且新生內(nèi)膜中已經(jīng)形成新生微血管，10天陽性更強(qiáng)；對照組5～15天內(nèi)膜面只有很少的細(xì)胞，Ⅷ因子染色是陰性

10、,20天雖然內(nèi)膜面雖有較多的細(xì)胞，但是Ⅷ因子染色仍是陰性。 (4)掃描電鏡結(jié)果：RGD組術(shù)后5天內(nèi)膜面可見較多的上皮樣細(xì)胞順血流方向排列，但是細(xì)胞之間有間距，術(shù)后10天內(nèi)膜面附著一層排列致密、整齊的內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞間可見形成的牢固連接；對照組術(shù)后10天內(nèi)膜面仍是增厚的纖維素樣物質(zhì)，下面似有細(xì)胞突起，可能為平滑肌或成纖維細(xì)胞，表面無內(nèi)皮樣細(xì)胞覆蓋，只是黏附一些大分子物質(zhì)和散在的一些小細(xì)胞。 (5)內(nèi)膜厚度的比較：術(shù)后第5天，

11、RGD組新生內(nèi)膜較對照組厚，但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨后的10天、15天、20天RGD組新生內(nèi)膜均較對照組薄，而且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組新生內(nèi)膜總體上說隨著時(shí)間的延長，厚度越來越大，術(shù)后15天時(shí)達(dá)到高峰，20天即開始下降，RGD組術(shù)后10天新生內(nèi)膜厚度有波折，其在20天時(shí)下降到術(shù)后5天的水平，而對照組厚度值仍然較大。 結(jié)論：RGD表面修飾的牛頸靜脈，體外能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附與生長，體內(nèi)能快速達(dá)到內(nèi)皮化的效果，雖然仍然伴有內(nèi)膜的增生，但是