JWA、bcl-2基因?qū)s-,2-O-,3-聯(lián)合維生素C、GM-CSF誘導(dǎo)HL-60、NB4細(xì)胞分化和凋亡的影響及可能機(jī)制.pdf

1、JWA(AF070523)是周建偉等從培養(yǎng)的原代人氣管和支氣管上皮細(xì)胞中分離并克隆的受全反式維甲酸(alltransretinoicacid，ATRA)誘導(dǎo)的新的細(xì)胞骨架樣基因。JWA基因cDNA包含2114個(gè)核苷酸，編碼188個(gè)氨基酸，其啟動(dòng)子序列中含有多種反應(yīng)元件，如TRE、SRE和RARE等。前期的研究結(jié)果表明JWA受多種誘導(dǎo)分化劑和環(huán)境應(yīng)激等調(diào)節(jié)，其功能與白血病細(xì)胞的分化和凋亡有關(guān)。十多年來，三氧化二砷(As2O3或ATO)已成

2、為全世界公認(rèn)的治療難治和復(fù)發(fā)性APL(AML-M3)的有效藥物。近期的研究已經(jīng)證明ATO的促凋亡作用并不只是針對(duì)M3，對(duì)非M3-AML也有作用，盡管后者對(duì)ATO的敏感性只有前者的1/10或更少。然而，長(zhǎng)期接觸砷劑所造成的毒性作用和潛在致癌性卻不容忽視。探求與ATO具有協(xié)同作用的聯(lián)合治療，最大可能地減少ATO劑量，降低細(xì)胞毒作用已成為該領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)。維生素C(AA)是一種細(xì)胞因子信號(hào)通路的調(diào)節(jié)子，作為有望誘導(dǎo)本身對(duì)ATO并不敏感的細(xì)胞發(fā)

3、生分化和凋亡的藥物而備受人們的關(guān)注。G-CSF、GM-CSF等生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，而ATO的分子靶向作用很大程度上取決于靶細(xì)胞內(nèi)ROS的濃度。本研究的目的在于通過研究JWA、bcl-2基因?qū)Φ蛣┝緼TO與維生素C、GM-CSF聯(lián)合誘導(dǎo)HL-60、NB4細(xì)胞分化和凋亡的影響，進(jìn)一步探討ATO聯(lián)合用藥在不同白血病作用的分子基礎(chǔ)，為臨床制定合理的治療方案提供更多的理論依據(jù)。同時(shí)，對(duì)201例白血病患者和243例健康者對(duì)照進(jìn)行了JWA基因單核

4、苷酸多態(tài)性(SNP)分析，試圖進(jìn)一步從分子流行病學(xué)的角度對(duì)JWA基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人群白血病發(fā)病的危險(xiǎn)性進(jìn)行相關(guān)性研究，探討2JWA基因SNP與各類白血病易感性的聯(lián)系，為白血病的預(yù)防和治療提供新的理論依據(jù)。 一、JWA、bcl-2基因?qū)TO聯(lián)合AA、GM-CSF誘導(dǎo)HL-60、NB4細(xì)胞分化和凋亡的影響及意義： 本課題在既往單藥誘導(dǎo)HL-60、NB4細(xì)胞等分化和/或細(xì)胞凋亡模型中JWA及相關(guān)抗凋亡基因bcl-2、hs

5、p70等表達(dá)研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步以HL-60細(xì)胞株為非M3的AML研究模型、NB4細(xì)胞株為M3研究模型，分別以ATO(1μM)聯(lián)合AA(300μM)和/或GM-CSF(20ng/ml)處理上述細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀(FCM)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析以及蛋白印跡(Westernblot)等技術(shù)初步比較了經(jīng)各組藥物作用后HL-60和NB4細(xì)胞分化及凋亡的動(dòng)態(tài)變化；比較JWA和bcl-2基因在蛋白水平表達(dá)趨勢(shì)的異同，探討ATO為主的聯(lián)合方案對(duì)M3和

6、非M3白血病細(xì)胞分化及凋亡影響可能的作用機(jī)制。我們的研究結(jié)果提示： 1.低濃度ATO(1μM)處理HL-60細(xì)胞后，JWA基因隨作用時(shí)間延長(zhǎng)有所上升，72h最為明顯；CD11b表達(dá)增加，細(xì)胞出現(xiàn)分化；而bcl-2基因則無有意義的變化。同樣劑量ATO處理NB4細(xì)胞后，則出現(xiàn)顯著的細(xì)胞凋亡特征。特別是ATO處理NB4細(xì)胞72h時(shí)，F(xiàn)CM檢測(cè)細(xì)胞凋亡率達(dá)55.7﹪，是同組同時(shí)段HL-60細(xì)胞的14倍之多；bcl-2基因的表達(dá)與JWA基

7、因呈正相關(guān)。 2.ATO聯(lián)合AA(300μM)處理HL-60細(xì)胞48h時(shí)大多細(xì)胞出現(xiàn)了分化跡象，少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)間依賴性細(xì)胞壞死；JWA基因在48h前呈時(shí)間依賴性增高，72h時(shí)反而較48h時(shí)表達(dá)減低。而ATO+AA處理NB4細(xì)胞后，72h時(shí)細(xì)胞凋亡率比同時(shí)段ATO組減少3.5倍；JWA基因在48h前均呈明顯下調(diào)趨勢(shì)，而72h時(shí)較48h有所上調(diào)，與同組處理HL-60細(xì)胞相同時(shí)段的變化規(guī)律呈負(fù)相關(guān)。 3.以上結(jié)果提示：同樣濃度

8、的ATO±AA在HL-60細(xì)胞主要以誘導(dǎo)分化為主，其分化程度與JWA基因表達(dá)呈大致正相關(guān)；而NB4細(xì)胞則以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為主，與JWA基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。JWA基因可能在ATO聯(lián)合AA誘導(dǎo)HL-60及NB4細(xì)胞分化或凋亡中的作用不同。ATO與AA聯(lián)合用藥并不能強(qiáng)化ATO誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化的作用，bcl-2也未顯示有意義的變化，說明1μMATO+300μMAA在一定時(shí)間內(nèi)對(duì)3HL-60細(xì)胞的誘導(dǎo)作用并不受bcl-2基因的調(diào)控。 4

9、.ATO和GM-CSF(20ng/ml)聯(lián)合處理HL-60和NB4細(xì)胞，CD11b及細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析佐證兩者均出現(xiàn)細(xì)胞分化跡象，但JWA基因呈反向變化趨勢(shì)：即在HL-60細(xì)胞呈時(shí)間依賴性升高，而在NB4細(xì)胞則呈下調(diào)趨勢(shì)；bcl-2基因的表達(dá)在HL-60細(xì)胞與JWA呈負(fù)相關(guān)，而在NB4細(xì)胞則無有意義的變化。GM-CSF與ATO在誘導(dǎo)HL-60和NB4細(xì)胞分化方面具有較明顯的協(xié)同作用，但JWA基因的表達(dá)趨勢(shì)卻迥異，說明JWA基因在ATO和GM

10、-CSF聯(lián)合誘導(dǎo)M3及非M3白血病細(xì)胞分化中涉及不同的誘導(dǎo)分化機(jī)制，值得進(jìn)一步研究。 5.ATO+GM-CSF+AA三藥聯(lián)合作用模型中，HL-60細(xì)胞和NB細(xì)胞均表現(xiàn)為細(xì)胞增殖受抑，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死，bcl-2基因表達(dá)隨藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)明顯下降，說明GM-CSF和AA在體外細(xì)胞培養(yǎng)中所致的部分氧化應(yīng)激作用可能進(jìn)一步強(qiáng)化了細(xì)胞毒效應(yīng)。JWA基因均呈不規(guī)則的變化。提示JWA基因涉及的細(xì)胞生存調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，推測(cè)JWA

11、在誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡中具有雙重效應(yīng)。特別是三藥聯(lián)合作用后，使藥物間的相互作用更趨復(fù)雜。 6.GM-CSF與其他藥物聯(lián)合使用在誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡過程中具有協(xié)同效應(yīng)；三藥聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞和NB4細(xì)胞凋亡受bcl-2的調(diào)控。因此，臨床上應(yīng)充分地考慮GM-CSF、G-CSF等細(xì)胞因子的使用時(shí)機(jī)和合理配伍對(duì)于最大程度地殺滅白血病細(xì)胞、減少細(xì)胞耐藥、保護(hù)正常細(xì)胞功能的重要性。 二、JWA基因多態(tài)性與各類白血病發(fā)生的相關(guān)性

12、研究： 從上述細(xì)胞模型的研究結(jié)果以及課題組應(yīng)用反義寡核苷酸和RNA干涉技術(shù)下調(diào)或關(guān)閉JWA基因使ATRA、TPA等誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞、NB4細(xì)胞分化和凋亡能力明顯受抑的研究結(jié)果證明：JWA基因廣泛參與調(diào)節(jié)多種化學(xué)藥物誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞定向分化和凋亡。盡管如此，JWA作為一個(gè)潛在的功能基因，其關(guān)鍵的生物學(xué)功能和相關(guān)分子機(jī)制目前仍然不清楚。本課題對(duì)201例華東地區(qū)白血病患者及243例健康者JWA基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)進(jìn)行了比較

13、分析，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)JWA基因的SNP位點(diǎn)(-76G＞C和723T＞G)與白血病危險(xiǎn)性的相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但其中并未發(fā)現(xiàn)4白血病種類特異性，提示JWA基因的SNPs可能與白血病發(fā)生的總體機(jī)制相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)，-76C等位基因與白血病危險(xiǎn)性增加有關(guān)(-76GC：OR=1.88；95﹪CI=1.06～3.37，P=0.0403)；而723G等位基因則與白血病危險(xiǎn)性降低有關(guān)，(723TG：OR=0.55，95﹪CI=0.37～0.82，P=0.0