基因芯片篩選和分析As-,2-O-,3-誘導(dǎo)NB4細胞凋亡相關(guān)基因.pdf

1、[目的] 研究三氧化二砷(As2O3)對人類急性粒細胞性白血病細胞株NB4細胞生長、凋亡以及其周期的影響，篩選As2O3誘導(dǎo)NB4細胞凋亡相關(guān)的基因，探討As2O3抗腫瘤可能作用機制。 [方法] 用含有不同濃度As2O3的培養(yǎng)基培養(yǎng)NB4細胞，采用MTT法檢測不同時間點As2O3對NB4細胞增殖的抑制作用，利用流式細胞儀通過AnnexinVFITC/PI法檢測細胞凋亡，PI染色法檢測細胞周期，分別用CELLQue

2、st和MODIFit2.0軟件進行數(shù)據(jù)收集和處理，實驗結(jié)果經(jīng)SPSS13.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，觀察As2O3對NB4細胞凋亡的及細胞周期的影響。為深入研究As2O3對NB4細胞誘導(dǎo)凋亡時所涉及到的凋亡相關(guān)基因，抽提4μmol/1As2O3作用24h的細胞及對照組細胞的mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄將細胞cDNA進行生物素標(biāo)記，用美國Superarray公司的含269個目的基因的細胞凋亡和周期基因芯片進行雜交，GEArray軟件對結(jié)果進行分析，篩選出

3、As2O3誘導(dǎo)前后表達有差異的基因，用實時定量PCR驗證了芯片結(jié)果的可靠性。對獲得的基因進行生物信息學(xué)分析，探討As2O3誘導(dǎo)細胞凋亡可能的機制。 [結(jié)果] ①1～8μmol/LAs2O3能顯著抑制NB4細胞增殖，且這些變化呈明顯的時間和濃度依賴關(guān)系(時間-劑量效應(yīng))；②2、4、8μmol/LAs2O3作用于NB4細胞可以引起不同程度的細胞凋亡，與凋亡并行出現(xiàn)的是程度不等的G2/M期細胞周期阻滯。As2O3處理時間為12

4、h和24h其早期凋亡率和總凋亡率均與劑量呈線性正相關(guān)；As2O3處理時間為36h和48hNB4細胞以中晚期凋亡為主。不同濃度的As2O3使NB4細胞周期阻滯在G2/M期；③用細胞凋亡和細胞周期基因芯片雜交篩選出4μmol/lAs2O3作用24h后兩組細胞中表達有差異的基因共100條(占芯片基因總數(shù)的37.2％)，其中97條(97/100，97％)基因表達上調(diào)，3條(3/100，3％)基因表達下調(diào)。表達上調(diào)的基因主要包括腫瘤壞死因子配體和

5、受體家族、半胱氨酸家族、Bcl-2家族、DNA損傷檢測和P53途徑和細胞分裂周期蛋白和激酶等；④實時定量PCR驗證基因芯片結(jié)果，實時定量PCR結(jié)果與基因芯片結(jié)果基本相符，說明基因芯片結(jié)果可信度較高，實時定量PCR證實Bcl-2表達下調(diào)(在芯片結(jié)果中表達沒有變化)。 [結(jié)論] 1)As2O3對NB4細胞生長抑制呈時間-劑量關(guān)系，這種效應(yīng)與引起細胞凋亡和細胞周期阻滯(G2/M期)有關(guān)； 2)通過對基因芯片上表達水平發(fā)

6、生改變基因的分析推測，As2O3誘導(dǎo)NB4細胞凋亡是多種途徑共同作用的結(jié)果，其中Fas和Caspase途徑通路上的基因以及細胞周期調(diào)控相關(guān)的基因可能發(fā)揮了主要作用； 3)發(fā)現(xiàn)了三條(BAl1、BAI2和VEGI)與抑制血管增生有關(guān)的基因表達上調(diào)，充實了As2O3通過抑制血管增生發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的分子機理； 4)As2O3促進細胞凋亡的同時有部分促存活的基因表達上調(diào)可部分解釋As2O3既可作為抗腫瘤藥物又具有致癌性，也可為臨