VPA促進(jìn)冬凌草甲素誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　冬凌草甲素（oridonin，ORI）是從傳統(tǒng)中藥冬凌草中提取出來(lái)的四環(huán)二萜類(lèi)天然有機(jī)化合物，是冬凌草中發(fā)揮作用的主要成分，具有抗炎、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能，近年來(lái)，研究表明冬凌草甲素能抑制乳腺癌、宮頸癌、肝癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，也能抑制急性白血病的惡化，是一種理想的治療急性白血病的藥物。組蛋白去乙?；敢种苿℉DACi）能抑制組蛋白脫乙酰酶，增加組蛋白過(guò)乙?；瘜?dǎo)致染色體重組、細(xì)胞周期停滯、誘導(dǎo)細(xì)胞分化和

2、凋亡等一系列生物學(xué)作用。研究表明，VPA作為一種組蛋白去乙?；敢种苿瑔为?dú)或者與其他藥物聯(lián)合作用可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗白血病的作用。
　　為了增強(qiáng)中藥ORI療效同時(shí)降低化療藥物 VPA副作用，本研究將小劑量ORI和VPA進(jìn)行聯(lián)合用藥，觀察他們對(duì)急性早幼粒白血病細(xì)胞 HL-60細(xì)胞增殖和凋亡的影響并探討其作用機(jī)制，為臨床治療急性早幼粒白血病提供新方案打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　目的：
　　探討VPA與冬凌草甲素（orido

3、nin，ORI）聯(lián)合誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　CCK-8法選取ORI和VPA最佳協(xié)同作用劑量；VPA和ORI單獨(dú)或聯(lián)合作用于HL-60細(xì)胞后光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化以及 Hoechst33342染色后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化；AnnexinV/PI試劑盒檢測(cè)HL-60細(xì)胞凋亡率；RT-PCR檢測(cè)Bax/Bcl-2等凋亡相關(guān)基因mRNA水平改變；并通過(guò)RT-PCR篩選參與外源性信號(hào)通

4、路的死亡受體配體對(duì)；Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)基因caspase-8、caspase-9的蛋白表達(dá)和caspase-3剪切片段的表達(dá)；預(yù)先加入或不加入caspase抑制劑處理HL-60細(xì)胞，采用Annexin V/PI流式試劑盒檢測(cè)兩藥聯(lián)合后細(xì)胞凋亡的變化；Western blot檢測(cè) ERK、Pi-ERK，P38、Pi-P38，JNK、Pi-JNK的蛋白表達(dá)；分別加入MAPK抑制劑后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，并通過(guò)WB檢測(cè)c

5、aspase-3的蛋白表達(dá)；建立APL動(dòng)物模型驗(yàn)證ORI+VPA能否誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：
　　冬凌草甲素與VPA聯(lián)合治療抑制HL-60細(xì)胞增殖；VPA增強(qiáng)冬凌草甲素誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡；光學(xué)顯微鏡下和Hoechst33342染色后熒光顯微鏡下觀察：ORI+VPA組比單獨(dú)用藥組細(xì)胞凋亡率多；冬凌草甲素和 VPA聯(lián)合作用激活 caspase-3、caspase-8和caspase-9；內(nèi)源性凋亡途徑中Bax蛋白表達(dá)

6、增高，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)降低；外源性凋亡途徑中死亡受體配體對(duì)Fas/fasl表達(dá)增高；MAPK信號(hào)通路中ERK和P38發(fā)生磷酸化，而JNK未發(fā)生磷酸化；APL動(dòng)物模型中ORI+VPA組實(shí)體瘤體積最小，TUNEL結(jié)果顯示ORI和VPA能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：
　　VPA確實(shí)能促進(jìn) ORI誘導(dǎo) HL-60細(xì)胞凋亡，兩者具有協(xié)同作用；VPA+ORI誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡具有 caspase依賴(lài)性；凋亡通過(guò)內(nèi)源性和外源性