成人腦星形細(xì)胞瘤與基質(zhì)金屬蛋白酶1、3、7、9基因相關(guān)性研究.pdf

1、目的：基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases，MMPs)是高度保守的依賴于Zn<'2+>的蛋白水解酶家族，是腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵作用的酶之一。研究表明，多數(shù)MMPs在正常組織中表達(dá)量很低，而在腫瘤組織中，各種類型MMPs的表達(dá)均有不同程度的增高。MMPs不僅參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，也與腫瘤發(fā)生發(fā)展的許多因素有關(guān)，包括細(xì)胞的生長、凋亡、血管生成和免疫監(jiān)視等。MMPs基因啟動子區(qū)的單核苷酸多態(tài)性(S

2、ingle Nucleotide Polymo：rphism，SNPs)可能影響其基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而影響腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。腦膠質(zhì)瘤(Glioma)是最常見的原發(fā)性腦腫瘤，盡管近年來在影像診斷、神經(jīng)外科技術(shù)、放射治療、化療等方面已取得較大進展，該腫瘤的生存率并無明顯提高。星形細(xì)胞瘤(Astrocytoma)是腦膠質(zhì)瘤中最常見的病理類型，其病因尚未明確，近年研究提示遺傳因素可能在星形細(xì)胞瘤的發(fā)生中起重要作用。鑒于

3、有報道顯示MMPs在星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)增高，我們推測，其啟動子區(qū)的基因多態(tài)性可能通過改變轉(zhuǎn)錄活性而影響星形細(xì)胞瘤的發(fā)生。最近，McCteady等的研究顯示，多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的MMP-12G/1G SNP可能在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤形成和侵襲中發(fā)揮作用，其他MMPs基因多態(tài)性與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的關(guān)系國內(nèi)外尚未見報道。另外，MMPs基因啟動子區(qū)多態(tài)性與腫瘤組織中MMPs蛋白表達(dá)及mRNA轉(zhuǎn)錄水平的關(guān)系尚不清楚。 為此，本研究擬通過基于我

4、院手術(shù)和病理證實的病例-對照研究，分析MMP-1、MMP-3、MMP-7和MMP-9基因啟動子區(qū)基因多態(tài)性與成人腦星形細(xì)胞瘤易感性的關(guān)系，同時觀察星形細(xì)胞瘤中MMP-1、3、7、9的蛋白及mRNA 的表達(dá)與星形細(xì)胞瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，特別是個體對星形細(xì)胞瘤的遺傳易感性及其發(fā)生、發(fā)展的分子機制，為星形細(xì)胞瘤的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。我們分三部分進行了研究。 第一部分 MMP-1、3、7、9基因啟動子區(qū)多態(tài)性與成人星形細(xì)胞瘤的關(guān)聯(lián)研

5、究 方法 采用基于醫(yī)院的病例對照方法。收集236例成人腦星形細(xì)胞瘤病例的手術(shù)標(biāo)本，經(jīng)組織學(xué)診斷后，以蛋白酶K消化、酚-氯仿抽提法提取腫瘤組織DNA。抽取366例健康對照外周靜脈血5ml，以蛋白酶K消化-飽和氯化鈉鹽析法提取白細(xì)胞DNA。MMP-1 -1607 2G/1G，MMP-3 -1171 5A/6A，MMP-7 -181A/G，MMP-9 -1562 C/T 基因型檢測應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析(P

6、olymerase Chain Reaction-RestrictionFragmerlt Length Polymorphlism，PCR-RFLP)方法進行。應(yīng)用卡方檢驗比較對照組及病例組基因型頻率的觀察值與預(yù)期值，進行Hardy-weinberg平衡檢驗。病例組與對照組的性別、基因型和等位基因型分布比較均采用四格表卡方檢驗。以非條件Logistic回歸法計算表示相對風(fēng)險度的比值比(Odds Ratio，0R)及其95％的可信區(qū)間(

7、Corlfidence Interval，CI)，并經(jīng)性別、年齡校正。 結(jié)果 1 MMP-1-1607 2G/1G SNP 的等位基因型及基因型總體分布在星形細(xì)胞瘤患者組和正常對照組之間有顯著性差異(分別為P=0.002和<0.001)。與2G/2G基因型相比，1G/1G基因型可顯著降低該腫瘤的發(fā)病風(fēng)險，經(jīng)性別、年齡校正的OR值為0.58(95％CI為0.42～0.79)，而2G/1G基因型對該腫瘤的易感性無顯著影響(校

8、正OR值為0.74，95％CI為0.51～1.08)。根據(jù)性別、發(fā)病年齡(≤45歲或>45歲)進行的分層分析顯示了相似的結(jié)果。根據(jù)WHO病理分級進行的分層分析顯示，1G/1G基因型均可顯著降低Ⅱ、Ⅲ級腫瘤的發(fā)病風(fēng)險，而對Ⅰ、Ⅳ級腫瘤的發(fā)病風(fēng)險無顯著影響。 2 MMP-3 -1171 6A/5A 多態(tài)性等位基因型及基因型總體分布在腫瘤組和正常對照組之間無顯著性差異(P>0.05)。根據(jù)性別、發(fā)病年齡(≤45歲或>45歲)、WHO病

9、例分級進行的分層分析顯示，腫瘤組和正常對照組之間的基因型分布均無顯著性差異。與MMP-3 6A/6A基因型相比，在總體比較及分層分析中均未發(fā)現(xiàn)6A/5A或5A/5A 基因型可改變星形細(xì)胞瘤的發(fā)病風(fēng)險，經(jīng)性別、年齡校正的OR值分別為1.09(95％CI=0.75～1.57)和0.95(95％CI=0.54～1.69)。 3 MMP-7 -181 A/G SNP的基因型及等位基因型分布在星形細(xì)胞瘤及正常對照組有顯著性差異(P=0.0

10、01)。與MMP-7 A/A基因型相比，A/G及G/G基因型可顯著增加星形細(xì)胞瘤的發(fā)病風(fēng)險，經(jīng)性別、年齡較正的OR值分別為1.69及2.77(95％CI=1.01～2.84及1.27～6.02)。根據(jù)發(fā)病年齡進行的分層分析顯示，與MMP-7 A/A基因型相比，G/G基因型可使45歲以下個體發(fā)生星形細(xì)胞瘤的風(fēng)險增加3倍左右(校正OR=3.16，95％CI=1.09～9.16)，而對45歲以上個體對此腫瘤的發(fā)病風(fēng)險無顯著影響。根據(jù)性別的分層

11、分析顯示，與MMP-7 A/A基因型相比，攜帶G/G基因型的男性個體發(fā)生星形細(xì)胞瘤的風(fēng)險可增加3倍以上(校正OR=3.24，95％CI=1.12～9.41)。根據(jù) WHO 病理分級進行的分層分析顯示，MMF-7 G/G基因型較A/A基因型攜帶者發(fā)生Ⅱ～Ⅳ級星形細(xì)胞瘤的風(fēng)險增加3倍左右，校正OR值分別為2.95(95％CI：1.21～7.17)，3.32(95％CI=1.15～9.61)，和3.25(95％CI：1.10～9.62)，且A

12、/G基因型可增加工工級星形細(xì)胞瘤的發(fā)病風(fēng)險約2倍(校正OR=2.06，95％CI=1.05～4.05)，而此MMP-7基因多態(tài)性對Ⅰ級星形細(xì)胞瘤的發(fā)病風(fēng)險無顯著影響。 4 MMP-9 -1562 C/T SNP 的等位基因型及基因型總體分布在腫瘤組和正常對照組之間無顯著性差異(P值分別為0.926和0.818)。 結(jié)論 1 總體分析及根據(jù)性別、發(fā)病年齡、病理分級進行的分層分析均顯示，MMP-3 -1171 5A/

13、6A多態(tài)性、MMP-9 -1562 C/T多態(tài)性不能改變星形細(xì)胞瘤的發(fā)病風(fēng)險； 2 MMP-1-1607 2G/1G多態(tài)性可影響星形細(xì)胞瘤的發(fā)病風(fēng)險。與人群中占分布優(yōu)勢的2G/2G基因型相比，1G/1G基因型可顯著降低該腫瘤的發(fā)病風(fēng)險； 3 MMP-7-181A/G多態(tài)性對星形細(xì)胞瘤發(fā)病風(fēng)險有明顯影響。與A/A基因型相比，攜帶G等位基因型(A/G和G/G基因型)可顯著增加個體對星形細(xì)胞瘤的發(fā)病風(fēng)險，此現(xiàn)象在45歲以下人群

14、、男性個體中尤為明顯。 第二部分 MMP-1、3、7、9蛋白表達(dá)與成人星形細(xì)胞瘤臨床病理分級的關(guān)系 方法 收集上述星形細(xì)胞瘤標(biāo)本中70例及8例腦外傷病人行手術(shù)內(nèi)減壓的腦組織石蠟包埋手術(shù)標(biāo)本。光鏡下常規(guī)病理形態(tài)學(xué)觀察，確定星形細(xì)胞瘤的病理診斷及病理分級(WHO 1999)。組織標(biāo)本MMP-1、3、7和9的蛋白表達(dá)以免疫組織化學(xué)方法檢測，采用即用型S-P試劑盒進行。各組數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性，采用Kendall’s tau

15、-b等級相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)用t<,b>值表示，P<0.05為顯著性檢驗水準(zhǔn)。不同組間蛋白表達(dá)陽性率比較用X<'2>檢驗。 結(jié)論 正常腦組織、Ⅰ～Ⅳ級星形細(xì)胞瘤組織中MMP-1、3、7和9蛋白的表達(dá)與星型細(xì)胞瘤的惡性程度顯著相關(guān)，可能為判斷該腫瘤的惡性程度、侵襲能力及預(yù)后的良好分子標(biāo)志物。 第三部分星形細(xì)胞瘤中MMP-1、3、7、9 mRNA表達(dá)及相關(guān)性探討 方法 取星形細(xì)胞瘤新鮮組織39例和正常新

16、鮮腦組織12例，所有組織在離體30分鐘內(nèi)置凍存管中，并立即置于液氮罐中，-80℃冷凍保存?zhèn)溆?。以一步法RNA抽提試劑盒提取組織細(xì)胞總RNA。以反轉(zhuǎn)錄法獲得cDNA第一鏈。采用TaqMan探針技術(shù)，以熒光實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(Real-timeQuantitative Polymerase Chain Reaction，RQ～PCR)，檢測組織中MMFs和內(nèi)參GAPDH mRNA的含量。以MMPs和內(nèi)參GAPDH mRNA含量的比值(

17、均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)作為評價MMt)s表達(dá)水平的指標(biāo)。采用 t 檢驗，統(tǒng)計分析星形細(xì)胞瘤病理分級各組與正常腦組織MMFs mRNA 表達(dá)水平的差異，以P<0.05為有顯著性差異。 結(jié)論 1 低分化星形細(xì)胞瘤組織(Ⅲ-Ⅳ級)中MMF-9 mRNA 表達(dá)量明顯高于正常腦組織及高分化腫瘤組織。MMP-9 mRNA 表達(dá)檢測可用來判斷星形細(xì)胞瘤的惡性程度及預(yù)后。 2 MMF-1、MMP～3 mRNA 表達(dá)量在非腦腫瘤組織和星形