胰島素受體基因的變異與結(jié)直腸癌易感性的研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一。近年來(lái)，胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路以及胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)家族被發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演非常重要的角色，而2型糖尿病、胰島素抵抗則會(huì)增加結(jié)直腸腫瘤的易感性，因此胰島素受體(IR)與結(jié)直腸腫瘤之間的相關(guān)性研究也逐漸引起關(guān)注。IR是細(xì)胞膜表面一種重要的大分子跨膜糖蛋白，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝和生長(zhǎng)、增殖、分化。胰島素受體基因(INSR)位于人基因組19p13.3-13.2區(qū)，由22個(gè)外顯子和2

2、1個(gè)內(nèi)含子組成，其第1-11號(hào)外顯子編碼α亞基，第12-22號(hào)外顯子編碼β亞基。編碼α亞基C端12個(gè)氨基酸殘基的第11號(hào)外顯子因?yàn)闀?huì)被變異性剪接，而使INSR存在兩種mRNA：缺少第11號(hào)外顯子的mRNA(EX11-)，翻譯的IR稱為IRA；含有第11號(hào)外顯子的mRNA(EX11+)，翻譯的IR稱為IRB。兩種受體在人體組織中的分布存在顯著差異，IRA在人體多種惡性細(xì)胞中高表達(dá)，包括結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、平滑肌肉瘤等

3、，IRA可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生。 單核苷酸多態(tài)性(SNPs)主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，它是基因組中最普遍的一種變異形式。SNPs不僅可以作為遺傳標(biāo)記，通過(guò)連鎖或關(guān)聯(lián)分析定位疾病易感基因，而且有些SNPs本身就可直接導(dǎo)致疾病或引起藥物/毒物反應(yīng)性的差異，因此，SNPs對(duì)多基因疾病的早期風(fēng)險(xiǎn)性評(píng)估、早期診斷和治療以及藥物基因組學(xué)等方面均有巨大的應(yīng)用價(jià)值。 我們分別從基因因素和代謝因素

4、兩方面探討胰島素受體基因的變異對(duì)結(jié)直腸癌易感性的影響以及可能的機(jī)制。 由于INSR基因編碼區(qū)的SNPs在中國(guó)漢族人群中總的分布情況，以及這些SNPs與結(jié)直腸癌的相關(guān)性分析目前罕有報(bào)道，因此我們選擇了100例中國(guó)漢族正常人和100例2000年至2004年在浙江大學(xué)附屬醫(yī)院住院的經(jīng)病理診斷確診為結(jié)直腸癌的患者作為研究對(duì)象，分別檢測(cè)了編碼IR主要功能部位的13個(gè)外顯子的SNPs在中國(guó)漢族正常人和結(jié)直腸癌患者中的分布情況(其中exon2

5、-6主要編碼胰島素結(jié)合部位，exon12編碼IRβ亞基的起始部位，exon17-22編碼IR的酪氨酸激酶活性部位，exon11則會(huì)影響IR的變異性剪接)。我們還對(duì)本次研究中發(fā)現(xiàn)的SNPs在結(jié)直腸癌患者和正常人群中基因型分布的差異進(jìn)行了分析。 通過(guò)變性高效液相色譜(DHPLC)結(jié)合測(cè)序的SNP技術(shù)分析平臺(tái)，我們?cè)贗NSR的13個(gè)外顯子中共發(fā)現(xiàn)了5個(gè)SNPs和1個(gè)突變，其中1個(gè)SNPs和1個(gè)突變是首次被發(fā)現(xiàn)。我們比較了這些SNPs位

6、點(diǎn)在中國(guó)正常人群和結(jié)直腸癌患者中基因型頻率的分布，以及它們與腫瘤患者的年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)侵犯、Dukes分期等臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，結(jié)果沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這些SNPs位點(diǎn)的基因型分布在兩組間有顯著差異，但發(fā)現(xiàn)261(C/T)位點(diǎn)的基因型頻率分布在腫瘤的發(fā)生部位之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示261(C/T)位點(diǎn)可能與腫瘤的發(fā)生部位有關(guān)。 此外，IRAA在人體大多數(shù)分化成熟的組織中低表達(dá)，而在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多

7、種惡性腫瘤中表達(dá)顯著升高，其機(jī)制目前尚未明確。我們分別就基因因素和代謝因素可能對(duì)結(jié)直腸癌中IR變異性剪接的影響展開(kāi)了研究。國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道INSR的intron10中存在多個(gè)影響exon11剪接的區(qū)域，其中intron10的5'端有一個(gè)剪接增強(qiáng)子區(qū)，能促進(jìn)exon11被保留；其3'端潛在的分支位點(diǎn)上游有一個(gè)43個(gè)核苷酸序列能促進(jìn)exon11被剪切；當(dāng)3'端潛在的分支位點(diǎn)被敲除后，細(xì)胞則幾乎完全表達(dá)IRA。SNPs位點(diǎn)rs3745548(A

8、/G)正位于intron10的5'端剪接增強(qiáng)子區(qū)，而rs2252673(C/G)則位于intron11的5'剪接位點(diǎn)區(qū)。既然IRA在結(jié)直腸癌中表達(dá)顯著上調(diào)，我們也初步分析了這兩SNPs在結(jié)直腸癌患者和正常人中的基因型頻率分布情況。運(yùn)用DHPLC技術(shù)，我們?cè)趇ntron10和intron11中檢測(cè)到了這兩個(gè)SNPs位點(diǎn)，且兩個(gè)位點(diǎn)在中國(guó)漢族人群中的雜合率均較高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，我們發(fā)現(xiàn)rs3745548(A/G)位點(diǎn)AA基因型的腫瘤患者更容易

9、發(fā)生淋巴結(jié)累及，提示AA基因型與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)，其機(jī)制是否是因?yàn)樵撐稽c(diǎn)位于剪接增強(qiáng)子區(qū)，會(huì)影響結(jié)直腸癌中IR的變異性剪接，有待進(jìn)一步分析。我們用這兩個(gè)高度連鎖不平衡的SNPs位點(diǎn)構(gòu)成單體型，分析了其與結(jié)直腸癌發(fā)病的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A-G單體型與結(jié)直腸癌腫瘤的低分化程度和高浸潤(rùn)能力呈正相關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)會(huì)增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。 隨后，我們研究了胰島素、葡萄糖，兩個(gè)IR功能重要組成部分的代謝因子，對(duì)結(jié)直腸癌中IR的變異性剪接的調(diào)

10、節(jié)作用，進(jìn)而推測(cè)它們是否可能是影響糖尿病患者的結(jié)直腸癌易感性的原因。我們用胰島素和高濃度葡萄糖分別處理結(jié)直腸癌細(xì)胞系RKO和SW620，并用兩種檢測(cè)方法，半定量RT-PCR和DHPLC的定量分析程序，檢測(cè)藥物處理前后IRA/IRB的表達(dá)比例變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰島素以及高糖處理RKO、SW620細(xì)胞后IRA表達(dá)均顯著上調(diào)。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明，胰島素和高糖均會(huì)影響結(jié)直腸癌中IR第11號(hào)外顯子的變異性剪接，主要會(huì)導(dǎo)致IRA表達(dá)上調(diào)。高胰島素血癥和高糖

11、血癥是2型糖尿病的主要臨床表現(xiàn)，因此我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示，2型糖尿病患者出現(xiàn)的高胰島素、高糖血癥導(dǎo)致IRA表達(dá)上調(diào)，可能是其結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加的重要原因。 綜上所述，我們可以得出以下結(jié)論：1.INSR基因的SNPs位點(diǎn)，261(C/T)、1085(C/T)、rs1051690(G/A)、rs3745548(A/G)、rs2252673(C/G)，以及rs3745548(A/G)和rs2252673(C/G)構(gòu)成的單體型與結(jié)直腸

12、癌的易感性之間沒(méi)有相關(guān)性，提示INSR基因水平的多態(tài)性可能不是影響結(jié)直腸癌易感性的主要因素。 2.多態(tài)位點(diǎn)261(C/T)與結(jié)直腸癌的發(fā)生部位之間有相關(guān)性，而rs3745548(A/0G)的AA基因型則可能會(huì)影響結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)累及。 3.多態(tài)位點(diǎn)rs1051690(G/A)、rs3745548(A/G)構(gòu)成的單體型的A-G基因型與結(jié)直腸癌腫瘤的低分化程度和高浸潤(rùn)能力呈正相關(guān)性。 4.代謝因素，胰島素和高糖，均會(huì)