內(nèi)皮脂肪酶基因Thr111Ile和Gly26Ser多態(tài)性與脂蛋白代謝及冠心病的關(guān)系.pdf

1、目的與背景:內(nèi)皮脂肪酶(endothelialipase，EL)是1999年被發(fā)現(xiàn)的一個(gè)脂肪酶家族新成員。1999年Hirata等用削減雜交在培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中首次克隆到了EL，同年，Jaye利用其他方法也證實(shí)了EL。序列分析顯示EL與脂蛋白脂肪酶(lipoproteinLipase，LPL)有45％的同源性，與肝脂肪酶(hepaticlipase，HL)有40％的同源性，與胰脂酶(pancreaticlipasePL)有27％的

2、同源性。因?yàn)檫@種脂肪酶由內(nèi)皮細(xì)胞合成并在此發(fā)揮作用，所以被命名為內(nèi)皮脂肪酶。2002年，Delemos等發(fā)現(xiàn)EL基因Thr111Ile和Gly26Ser等6個(gè)位點(diǎn)變異有潛在功能。2003年，Ishida等研究發(fā)現(xiàn)EL是調(diào)節(jié)高密度脂蛋白(high-densitylipoprotein，HDL)的關(guān)鍵酶，EL過量表達(dá)的動物會出現(xiàn)HDL膽固醇水平下降，而缺EL基因動物HDL膽固醇水平則顯著升高。而既往研究已證實(shí)，HDL膽固醇水平升高是動脈粥樣

3、硬化的保護(hù)因素。本文觀察EL基因Thr111Ile和Gly26Ser多態(tài)性對脂蛋白代謝的影響，旨在進(jìn)一步探討二者與冠心病的關(guān)系。 材料與方法: 一、研究對象均為本院2002年12月至2005年5月間住院行選擇性冠狀動脈造影病人，共438例。冠狀動脈造影采用Judkins法，造影結(jié)果由2名有經(jīng)驗(yàn)醫(yī)師確定。冠狀動脈造影證實(shí)左前降支(LAD)、左回旋支(LCX)、右冠狀動脈(RCA)中至少有1支血管內(nèi)徑狹窄≥50％為陽性。

4、 根據(jù)造影結(jié)果分為兩組：冠心病組，共242例，男180例，女62例，平均年齡64.74±9.52歲，均符合1979年WHO關(guān)于缺血型心臟病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，冠脈造影陽性。 對照組，共196例，男112例，女82例，平均年齡60.35±11.23歲，冠脈造影陰性。所有研究對象均肝腎功能正常。 所有研究對象均來自浙江地區(qū)漢族人群，相互間無血緣關(guān)系。 二、方法 1.DNA提取采集外周靜脈血2ml，枸椽酸鈉抗凝，低

5、滲溶血法獲得白細(xì)胞，以鹽析法提法提取DNA，TE溶解于-70℃保存。 2.Thr111Ile及Gly26Ser多態(tài)性PCR擴(kuò)增參照Delemos等提出的引物(由上海生物工程公司合成)，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增特異性基因片段。Thr111Ile上游引物序列：5’-GCCTGTAACCCAGTCACTCTGGAG-3’下游引物序列為5’-CTACATTGGCGTCTTTCTCTCAT-3’Gly26Ser上游引物序列：5’

6、-AAGGTGTGACCAATCAGAGCCC-3’下游引物序列為5’-CAGCACAGAGAAGTGGCTGGG-3’。PCR反應(yīng)體系(25ul)包括：200ng的DNA模板，10μmol/L的引物，200μmol/L的dNTP，1.5mmol/L的MgCl2，50mmol/L的KCl，10mmol/L的Tris-HCl各1μl，1.5U的TaqDNA聚合酶。PCR反應(yīng)條件：變性95℃5min，循環(huán)95℃1min，61.5℃30s，7

7、2℃1min，共35個(gè)循環(huán)，再72℃延伸10min結(jié)束。 3.Thr111Ile及Gly26Ser基因分型Thr111Ile限制性內(nèi)切酶為NdeI，Gly26Ser限制性內(nèi)切酶為AvaⅡ。酶切體系為10μl，包括5μl的PCR產(chǎn)物。Thr111Ile酶切體系在37℃水浴過夜，Gly26Ser酶切體系在37℃水浴2小時(shí)。PCR及酶切產(chǎn)物于2％瓊脂糖電泳—溴化乙錠染色法(EB)進(jìn)行檢測分型。用紫外線凝膠成像系統(tǒng)判定結(jié)果。 4

8、.血脂的測定空腹12小時(shí)采肘靜脈血，用OlympusAU1000全自動分析儀酶法檢測血漿總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)水平。 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)均以SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析處理?；蛐秃偷任换蝾l率采用直接計(jì)數(shù)法，行x2檢驗(yàn)。計(jì)量資料采用x±s表示，均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)后行t檢驗(yàn)?；蚨鄳B(tài)性與血脂及冠心病關(guān)系行多元Logistic逐步回歸分析。以

9、p＜0.05為存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 結(jié)果: 1.Thr111Ile基因型和等位基因分布Thr111Ile的PCR擴(kuò)增片段大小為308bp，若存在Thr111Ile突變，則形成NdeI酶切位點(diǎn)，將此片段切為282bp和26bp，由于26bp片段分子量較小，在2％瓊脂糖電泳中難以顯示，所以基因型區(qū)別標(biāo)準(zhǔn)如下：CC基因型(308bp)，CT基因型(282bp，308bp)、TT基因型(282bp)。Thr111Ile的突變率為2

10、3.3％.冠心病與對照組基因型及等位基因頻率分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，未發(fā)現(xiàn)突變純合子TT基因型。 2.Thr111Ile多態(tài)性CC組與CT組臨床特征比較CT組HDL-c水平明顯高于CC組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。 3.以Thr111Ile多態(tài)性(是否突變)為因變量，性別、年齡、TC、TG、HDL-c、LDL-c為自變量，行多元Logistic回歸分析，見突變?nèi)耘c高HDL-c水平有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜

11、0.05)。 4.以冠心病為因變量，性別、年齡、TC、TG、HDL-c、LDL-c、Thr111Ile突變?yōu)樽宰兞?，行多元Logistic回歸分析，冠心病與年齡、性別、TG有關(guān)(p＜0.01)，未見冠心病與Thr111Ile突變有關(guān)(p＞0.05)。 5.Gly26Ser基因型和等位基因的分布Gly26Ser的PCR擴(kuò)增片段大小為506bp，若無Gly26Ser突變，則存在AvaⅡ酶切位點(diǎn)，將此片段切為440bp和66b

12、p，由于66bp片段分子量較小，在2％瓊脂糖電泳中顯示困難，故基因型區(qū)別標(biāo)準(zhǔn)如下：GG基因型(440bp)，GT基因型(440bp，506bp)、TT基因型(506bp)。本研究未能發(fā)現(xiàn)Gly26Ser的GT及TT基因型，故突變率為0.0％。 結(jié)論:冠心病人群中存在Thr111Ile多態(tài)性。Thr111Ile的突變率為23.3％，未發(fā)現(xiàn)突變純合子TT基因型。Thr111Ile多態(tài)性中的CT基因致HDL-c水平升高，但未發(fā)現(xiàn)其與C