豬脂蛋白脂酶（LPL）和激素敏感脂肪酶（HSL）基因的序列和多態(tài)性分析及體外表達的研究.pdf

1、在現(xiàn)代動物育種實踐中，通過在分子水平上識別控制重要經(jīng)濟性狀的遺傳標記或者基因座，以便在早期或超早期直接對個體進行選擇是一種極為重要的手段，也是為廣大育種工作者廣泛采用的一種方法。這種借助分子標記輔助選擇(MAS)進行豬的遺傳改良、提高豬的生產(chǎn)性能的方式的前提是必須找到盡可能多的合適的遺傳標記信息。 本實驗以脂蛋白脂酶(LPL)和激素敏感脂肪酶(HSL)基因作為豬脂肪代謝相關(guān)性狀的侯選基因，主要著眼于發(fā)現(xiàn)新的單核苷酸多態(tài)性(Sin

2、gleNucleotidePolymorphisms，SNPs)位點和有效的分子標記信息。同時也開展了豬LPL和HSL基因的原核和真核的體外表達，為通過基因工程的手段來調(diào)控豬脂肪代謝的研究做了初步的探索。主要研究結(jié)果如下： 1.通過提取不同品種豬的脂肪組織的RNA、進行RT-PCR，得到不同品種豬的HSL和LPL基因的全長cDNA序列。利用CLUSTALW軟件對豬和從Genbank數(shù)據(jù)庫中所搜尋到的相關(guān)動物物種的HSL和LPL基

3、因進行進化樹分析，初步了解基因在不同物種中的親緣關(guān)系。 2.根據(jù)已測的LPL基因的外顯子序列擴增并克隆LPL基因內(nèi)含子3、5，BLAST比對發(fā)現(xiàn)有20處SNPs，選取直接導(dǎo)致限制性酶切位點的SNPs進行多態(tài)性與性狀的關(guān)聯(lián)研究。 3.在F2群體中，內(nèi)含子3的NheI酶切位點的AA、AB、BB三種基因型在皮率、眼肌高性狀上存在顯著性(p＜0.05)和極顯著性(p＜0.01)的差異。均表現(xiàn)為加性效應(yīng)的作用方式，且達極顯著水平。

4、 4.內(nèi)含子3中的EcoT22I酶切位點在F2群體中的研究發(fā)現(xiàn)，AA、BB基因型在6-7肋處膘厚、皮厚、骨率性狀上達到顯著性(p＜0.05)和極顯著性(p＜0.01)。均以加性效應(yīng)作用為主，達到了顯著性水平(P＜0.05)。 5.在F2豬群體中，內(nèi)含子3中的NcoI酶切位點的AA、AB、BB基因型在胴體性狀的眼肌高、眼肌寬、眼肌面積上均達到顯著性水平(p＜0.05)。眼肌高是以加性效應(yīng)的方式為主的(p＜0.05)；而眼肌

5、寬、眼肌面積則以顯性效應(yīng)作用方式為主的(p＜0.05)。在肉質(zhì)性狀上NcoI酶切位點的三種基因型在pH(LD)、pH(BF)、色值(BF)、肌內(nèi)脂肪上達到顯著性(p＜0.05)和極顯著性(p＜0.01)水平。是以顯性效應(yīng)為主的(p＜0.05)。 6.內(nèi)含子5中的AfaI位點的三種基因型在F2群體胴體性狀的屠宰率和胸腰部膘厚上存在著顯著性差異(p＜0.05)。以加性效應(yīng)方式為主，但未達顯著性水平。而在AfaI位點的肉質(zhì)性狀上，三種

6、基因型在pH(LD)、pH(BF)、pH(SC)、WHC以及WLR和MC1性狀上均達到極顯著性水平(p＜0.01)。以加性效應(yīng)作用為主(p＜0.01)。 7.內(nèi)含子5的ScaI酶切位點在F2大梅豬群體中只存在AA和AB兩種基因型。 8.HSL、LPL基因在大腸桿菌中的表達根據(jù)我們從豬中克隆的HSL、LPL基因的編碼序列，將其克隆到pET-28a表達載體上，分別構(gòu)建成原核表達質(zhì)粒pET-28a-HSL、pET-28a-LP

7、L，使其在E.coliBL21(DE3)中以IPTG誘導(dǎo)表達，經(jīng)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，LPL獲得較好的表達，而HSL沒有表達。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，LPL表達產(chǎn)物以包涵體的形式存在。從包涵體中提取LPL表達產(chǎn)物，并用比色法檢測酶活性，發(fā)現(xiàn)該酶具有酶活性。 9.HSL、LPL基因在巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)中的表達我們把從豬中克隆的HSL、LPL基因的編碼序列，克隆到pPIC9K表達載體上，構(gòu)建成真核表達質(zhì)粒pPIC