花生凝集素介導(dǎo)的結(jié)腸癌靶向給藥系統(tǒng)的研究.pdf

1、結(jié)腸癌是胃腸道常見腫瘤。放療對結(jié)腸癌敏感性較差及小腸毒副作用明顯。常規(guī)化療時，由于抗腫瘤藥物通常缺乏區(qū)分正常細胞和惡性腫瘤細胞的選擇性，容易引起全身的毒副作用、降低患者對治療的耐受性。腫瘤靶向治療有望將抗腫瘤藥物選擇性地集中在腫瘤組織，而沒有臨床上區(qū)域動脈灌注所帶來的手術(shù)痛苦和風(fēng)險，因而是較好的替代方法。目前，腫瘤靶向治療最大的障礙是缺乏合適的具有特殊識別能力的藥物載體。尋找選擇性強、能夠有效載帶抗腫瘤藥物的靶向載體，并考察其在體內(nèi)的靶

2、向性及在腫瘤模型中的活性，是靶向治療研究中的熱點領(lǐng)域。 近年來，凝集素在腫瘤研究中的應(yīng)用受到了越來越廣泛的關(guān)注。人體細胞膜含有豐富的糖蛋白和糖脂，其中糖類部分的單糖和寡糖可與凝集素發(fā)生特異性的親和結(jié)合，不同細胞的受體由于所含糖的結(jié)構(gòu)不同，只能與特定的凝集素結(jié)合，從而使凝集素具有“識別”某種細胞的能力。而且，某些腫瘤細胞存在著特異性的凝集素受體。此外，凝集素?zé)o免疫源性、與單糖及糖復(fù)合物中的糖結(jié)構(gòu)部分的識別具有高度特異性、具有多價結(jié)

3、合能力并且結(jié)合了某些藥物、毒性蛋白、放射性同位素后其活性保持不變。因此，凝集素在腫瘤的靶向治療中有著極好的應(yīng)用前景。將抗腫瘤藥物與凝集素偶聯(lián)，選擇合適的凝集素或許可以控制細胞對偶聯(lián)物的攝取和其在細胞內(nèi)的傳遞途徑，從而實現(xiàn)腫瘤治療真正意義上的細胞靶向。但目前，有關(guān)其在腫瘤靶向治療中的作用的研究尚在起步階段。 花生凝集素(PNA)是從花生中提取并純化的一種蛋白質(zhì)，具有如下主要特點：1)不凝集正常的淋巴細胞和血液細胞，如紅細胞、白細胞

4、；2)花生凝集素是種子植物的組成成分，亦是人常常食用的營養(yǎng)物質(zhì)，無明顯毒副作用；3)對酸性環(huán)境和多種酶有較好抗性；4)具有多價結(jié)合能力；5)結(jié)直腸腫瘤細胞上PNA受體與正常組織之間存在顯著性差異，在大量癌變的結(jié)腸上皮細胞的細胞膜上和細胞的頂端胞漿內(nèi)出現(xiàn)了PNA結(jié)合位點。以上特點說明PNA具有作為抗腫瘤藥物載體用于腫瘤靶向治療的可能性。 本課題選擇治療胃腸道腫瘤的一線藥物5-氟尿嘧啶(5-Fu)作為模型藥物，以在胃腸道腫瘤有高表達

5、受體的花生凝集素為靶向載體，通過EDC/NHS一步法制備出可口服給藥的5-Fu-PNA前體偶聯(lián)物。綜合考察了該偶聯(lián)物的制備工藝、特異單糖對凝集素生物活性的保護作用和體外穩(wěn)定性以及偶聯(lián)物的電泳性質(zhì)。采用流式細胞儀和熒光顯微鏡，以人結(jié)腸癌細胞LoVo和人正常肝細胞Chang作為代表性細胞模型，通過模型細胞熒光強度的變化對偶聯(lián)物的細胞作用機制進行探討。并采用MTT法考察該偶聯(lián)物的細胞毒性、特異性和選擇性。從而在體外對PNA為載體的腫瘤細胞主動

6、靶向給藥系統(tǒng)的可行性進行系統(tǒng)評價。該研究未見報道。本研究將豐富靶向給藥系統(tǒng)的研究內(nèi)容和科學(xué)基礎(chǔ)，為靶向給藥系統(tǒng)的研究提供一個新的領(lǐng)域。 本研究首先進行了5-氟尿嘧啶-花生凝集素偶聯(lián)物(5-Fu-PNA)的制備研究。偶聯(lián)反應(yīng)時，如何保護蛋白質(zhì)不變性，實現(xiàn)藥物與凝集素載體的偶聯(lián)，避免凝集素的自身交聯(lián)，保留凝集素的生物活性同時得到較高的藥物連接率，是本試驗研究的重點和難點。采用蛋白質(zhì)常用的修飾方法EDC法制備時，需要先進行羧基的活化，

7、但由于5-Fu不含羧基，只有選擇凝集素先進行活化。但凝集素本身也含有氨基基團，活化的同時就可能導(dǎo)致凝集素的自身交聯(lián)，從而使得偶連物的載藥量降低、生物活性丟失、后續(xù)的藥效學(xué)藥理學(xué)評價無法進行。因此，本試驗選擇了將5-Fu進行衍生化，得到了1-N-羧基取代5-Fu，并采用EDC/NHS法對1-N-羧基取代5-Fu進行活化，形成具有較高穩(wěn)定性的活性酯。再采用D-半乳糖保護凝集素活性中心的方法，將活性酯與花生凝集素PNA連接，得到藥物與載體的酰

8、胺鍵共價偶聯(lián)物。 以C57小鼠胸腺細胞凝集實驗法檢測偶連物生物活性，建立了TNBS法測定藥物連接率。并以生物活性和藥物連接率為指標(biāo)考察了1-N-乙酸取代5-Fu、EDC與NHS三者摩爾比、12h和24h的連接反應(yīng)時間、D-半乳糖(D-gal)加入量對偶連物連接的影響。結(jié)果表明，1-N-乙酸取代5-Fu、EDC與NHS三者摩爾比為1：5：2，連接反應(yīng)時間為12h，D-半乳糖(D-gal)加入量為PNA的2.5倍以上時，可制得藥物連

9、接率38.42％、凝集活性完全保留的偶連物。達到了實驗設(shè)計目的。此外，對偶連物的性質(zhì)和體外穩(wěn)定性也進行了考察。偶連物在SDS-PAGE圖上出現(xiàn)了新的分子量增大約3kD的條帶。4℃放置一個月以上，凝集活性基本不變，可保持在85％以上。偶連物在人工腸液、37℃條件下，6h以內(nèi)活性不下降，可保持在95％以上。但在人工胃液、37℃條件下，5min時偶連物已經(jīng)完全降解。因此，可考慮將偶連物制成供口服的結(jié)腸制劑。 采用流式細胞術(shù)和熒光顯微鏡

10、對5-氟尿嘧啶-花生凝集素偶聯(lián)物與靶細胞LoVo和非靶細胞Chang的結(jié)合特點與內(nèi)化機理進行了探討。結(jié)果表明，5-Fu-PNA可與靶細胞LoVo發(fā)生特異性粘附，可被花生凝集素特異的單糖抑制。這種特異性粘附具有濃度依賴性，低濃度時靶細胞的熒光強度低于高濃度時的熒光強度。這種特異性粘附還具有溫度依賴性，4℃時靶細胞的熒光強度高于37℃時，提示偶連物可能被細胞內(nèi)化進入胞內(nèi)。與此相反，5-Fu-PNA幾乎不能結(jié)合非靶細胞Chang。證實了凝集素

11、介導(dǎo)的偶連物對目標(biāo)細胞的主動識別和選擇作用。 采用MTT試驗法評價了偶連物的細胞毒作用及特點，主要包括：1)5-Fu-PNA對靶細胞LoVo的細胞毒作用與游離藥物一樣，呈濃度依賴性和時間依賴性；2)與游離藥物相比，偶連物的作用時間滯后于游離藥物。當(dāng)5-Fu的濃度為8μM時，游離藥物殺死全部細胞需要96h，而偶連物需要120h，提示5-Fu-PNA在體內(nèi)可能具有緩釋效果；3)無活性偶連物和游離PNA對靶細胞幾乎不產(chǎn)生細胞毒作用。

12、 表現(xiàn)為在60μg/ml的高濃度下、48h的作用時間時，無活性偶連物和游離PNA組細胞存活率維持在90％以上，而活性偶連物組細胞存活率僅為48.41％，提示偶連物的細胞毒作用是特異性的；4)與對靶細胞LoVo的細胞毒作用相反，5-Fu-PNA對非靶細胞幾乎沒有細胞毒作用，而游離藥物對Chang細胞的作用與對LoVo細胞的作用是一致的。又一次證實了偶連物具有選擇性識別靶細胞的能力，其細胞毒作用是選擇性的。提示在體內(nèi)給藥時，偶連物可能