樹鼩慢性乙型肝炎病毒感染模型的探索.pdf

1、HBV感染人體以后可以造成急性肝炎、慢性肝炎,可發(fā)展為肝硬化,甚至導(dǎo)致肝細(xì)胞癌變,嚴(yán)重影響人類生命健康。雖然新生兒乙肝疫苗接種計(jì)劃有效降低了新發(fā)HBV感染的發(fā)生率,但對于全世界已有的龐大HBV慢性感染人群仍缺乏徹底、有效的治療措施。
　　對HBV感染致病機(jī)制的研究及防治藥物的研發(fā)離不開合適的動物感染模型。長期以來,黑猩猩是唯一可以被用于HBV感染研究的易感動物。然而,黑猩猩屬于瀕危珍稀動物、來源受限,其相對大型的體格、昂貴的使用成

2、本,以及受到倫理因素影響,黑猩猩作為實(shí)驗(yàn)動物的使用越來越受到限制。因此,人們迫切需要尋找其他更加方便、穩(wěn)定的小型動物作為模型以利于HBV研究的開展。
　　由于其嚴(yán)格的宿主特異性,HBV感染難以在除人類和黑猩猩以外的其他動物實(shí)現(xiàn),很多關(guān)于HBV的認(rèn)識都是通過對與HBV相似的其他病毒的研究獲得的。鴨乙型肝炎病毒(DuckhepatitisBvirus,DHBV)和土撥鼠肝炎病毒(Woodchuckhepatitisvirus,WHV)

3、與HBV同屬嗜肝DNA病毒,它們在各自宿主體內(nèi)的感染為人們了解屬嗜肝DNA病毒的感染復(fù)制周期及宿主免疫系統(tǒng)反應(yīng)提供了大量依據(jù)。但是鴨和土撥鼠與人類的遺傳背景差異較大,免疫背景不明確,檢測手段相對缺乏,加之上述肝炎病毒與HBV的種屬差異,從這些替代模型觀察到的現(xiàn)象并不能完全真實(shí)的反應(yīng)人類感染HBV的情況。
　　小鼠是應(yīng)用最廣泛的實(shí)驗(yàn)動物。用于HBV研究的小鼠模型包括HBV轉(zhuǎn)基因小鼠、水動力注射HBV基因組小鼠以及人/樹鼩—小鼠肝臟嵌

4、合體模型。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠被轉(zhuǎn)入了含有HBV完整基因組或部分基因組片段的HBVDNA,可以產(chǎn)生具有感染力的完整病毒顆粒或各種病毒成分;但是轉(zhuǎn)基因小鼠對HBV免疫耐受,不能用于機(jī)體免疫反應(yīng)及機(jī)體清除病毒機(jī)制的研究。水動力注射小鼠模型是將HBVDNA或含有HBVDNA的載體通過尾靜脈高壓注入血液中,使HBVDNA富集于肝臟并進(jìn)入肝細(xì)胞,發(fā)生HBVDNA的復(fù)制和表達(dá);此模型中HBV不能感染新的小鼠肝細(xì)胞,有限的HBV很快被免疫系統(tǒng)清除,不能用

5、于HBV慢性感染的研究。常用的肝臟嵌合體小鼠包括uPA/Rag2-/-小鼠、uPA/SCID、Fah?/?/Rag2?/?/Il2rg?/?(FRG)小鼠和Fah-/-/NOD/SCID小鼠等,這些嵌合體小鼠因被植入人類或樹鼩肝細(xì)胞后能夠感染HBV,病毒血癥可以達(dá)到較高水平并維持較長時(shí)間。該模型的主要缺陷是這些小鼠的純系繁殖體系的建立困難,并且缺乏成熟的特異性免疫系統(tǒng),不能用于研究宿主免疫系統(tǒng)對病毒的作用。
　　樹鼩(treesh

6、rews,tupaia)是一種外形類似松鼠的小型哺乳動物,在系統(tǒng)進(jìn)化上與靈長類關(guān)系密切,人們越來越關(guān)注其在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用。目前,樹鼩已經(jīng)被用做近視、糖尿病、社會應(yīng)激和抑郁癥等疾病的動物模型。除此以外,樹鼩還可以被人皰疹病毒(herpesvirushominis)、單純皰疹病毒(herpessimplexvirus)、博爾納病病毒(Bornadiseasevirus)、輪狀病毒(humanrotavirus)和丙型肝炎病毒(hepa

7、titisCvirus,HCV)等人類病毒感染,被廣泛應(yīng)用多種病毒感染性疾病的研究。
　　從20世紀(jì)80年代開始,國內(nèi)外陸續(xù)有報(bào)道證實(shí),樹鼩接種HBV后能在肝臟中檢測到HBV的感染和復(fù)制。雖然樹鼩已被證實(shí)能夠發(fā)生HBV感染,但其感染過程多為一過性,鮮有關(guān)于樹鼩慢性HBV感染的報(bào)道。樹鼩體內(nèi)HBV感染過程的短暫性使其不適于HBV慢性感染的研究,也不利于慢性乙型肝炎治療措施的評價(jià)。
　　在黑猩猩體內(nèi)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明病毒接種劑量對H

8、BV感染時(shí)限有顯著影響,其中101GEHBV接種主要導(dǎo)致慢性感染過程。此外,多個(gè)報(bào)道證實(shí)用免疫抑制劑抑制機(jī)體免疫功能,可以使體內(nèi)病原體感染的清除延遲。這為我們探索樹鼩體內(nèi)HBV慢性感染的條件提供了線索。本課題通過調(diào)整病毒接種劑量和持續(xù)免疫抑制兩種方使樹鼩接感染HBV,觀察處理措施對樹鼩體內(nèi)HBV感染進(jìn)程的影響,以探索有利于延長樹鼩體內(nèi)HBV感染時(shí)限的條件,為慢性HBV感染樹鼩模型的建立提供借鑒。
　　我們首先研究了病毒接種劑量對樹

9、鼩體內(nèi)HBV感染進(jìn)程的影響。成年雄性樹鼩分別經(jīng)腹腔接種含有101GE、102GE、104GE和108GEHBV的人類血清后,于特定時(shí)間點(diǎn)采集樹鼩血清,用于HBVDNA、HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAg和ALT的檢測,觀察HBV感染后的血清學(xué)指標(biāo)變化趨勢。此外,還通過活體取肝采集樹鼩肝組織標(biāo)本,用于檢測感染HBV后樹鼩肝組織中HBV特異抗原表達(dá)、HBVcccDNA含量以及病理學(xué)變化。結(jié)果顯示,以上不同劑量的HBV

10、接種后均能在血清中檢測到HBsAg、HBeAg和HBVDNA,經(jīng)過不同時(shí)間后出現(xiàn)HBeAb和HBsAb,發(fā)生HBsAg和HBeAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換,最終HBVDNA轉(zhuǎn)陰,HBV感染被清除。肝組織免疫組化染色能檢測到HBsAg和HBcAg陽性肝細(xì)胞的存在,并有HBVcccDNA的形成,更加充分證實(shí)了樹鼩體內(nèi)HBV感染的成功建立。樹鼩接種HBV后能觀察到血清中ALT水平升高,肝組織HE染色顯示存在肝細(xì)胞變性壞死和炎性細(xì)胞浸潤等病理改變,表明HB

11、V感染樹鼩能造成與人類乙型肝炎相似的病理變化。綜合血清學(xué)和組織學(xué)檢測結(jié)果分析,108GEHBV引起的HBV感染不超過3周,104GEHBV引起的HBV感染長達(dá)15周,101GE和102GEHBV引起的HBV感染均維持9周。據(jù)此,我們認(rèn)為病毒接種劑量能顯著影響樹鼩體內(nèi)HBV的感染時(shí)限,其中104GEHBV最有利于樹鼩HBV感染的維持。
　　此外,我們在一組樹鼩注射含HBV血清后還給予了隔天一次的氫化可的松注射,以觀察持續(xù)免疫抑制對樹

12、鼩感染HBV進(jìn)程的影響。由于免疫抑制,本組樹鼩容易發(fā)生其他病原體感染,所有樹鼩均在接種HBV后的12周內(nèi)死亡。在有限的觀察期內(nèi),該組樹鼩血清中HBVDNA、HBsAg和HBeAg持續(xù)陽性,肝組織中HBsAg和HBeAg陽性肝細(xì)胞持續(xù)存在,HBVcccDNA也能被持續(xù)檢出。直至觀察終點(diǎn)(第84天所有樹鼩死亡),本組所有樹鼩體內(nèi)的HBV均未被清除,說明本組樹鼩的HBV感染至少能維持12周。這些結(jié)果表明,用氫化可的松持續(xù)抑制樹鼩免疫功能可以顯

13、著延長HBV的感染時(shí)限。
　　通過本實(shí)驗(yàn),我們證實(shí)成年樹鼩能建立有效的HBV感染。樹鼩接種含HBV的血清后,可以在其血清中檢測到HBVDNA、HBsAg和HBeAg,肝組中有HBsAg和HBcAg的表達(dá)以及HBVcccDNA的形成,并出現(xiàn)與人類乙型肝炎相似的病理改變。我們發(fā)現(xiàn)病毒接種劑量和機(jī)體免疫狀態(tài)對樹鼩體內(nèi)的HBV感染進(jìn)程有明顯影響,104GEHBV接種和持續(xù)免疫抑制處理有利于HBV感染的維持。我們的研究為新型的HBV慢性感染