自噬在肢體缺血后處理對(duì)腦缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制.pdf

1、研究目的和意義:
　　我們前期研究發(fā)現(xiàn)肢體缺血后處理對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與激活P38MAPK等通路有關(guān)。自噬是通過依賴溶酶體途徑降解長(zhǎng)半衰期蛋白及細(xì)胞器的一種細(xì)胞內(nèi)自我分解代謝過程，是細(xì)胞生存、死亡的重要調(diào)節(jié)者。但肢體缺血后處理是否通過激活自噬對(duì)腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用及其具體機(jī)制如何尚未明確。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，并給予大鼠肢體缺血后處理，探討肢體缺血后處理是否通過激活自噬途徑發(fā)揮腦

2、保護(hù)作用，同時(shí)進(jìn)一步明確JNK和AMPK/mTOR信號(hào)通路是否是肢體缺血后處理激活自噬的上游通路，以期為肢體缺血后處理可能應(yīng)用于臨床實(shí)踐提供理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　第一部分:自噬參與肢體缺血后處理對(duì)腦缺血再灌注損傷的作用:實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組（I/R組）、缺血再灌注+肢體缺血后處理組(LpostC組)、缺血再灌注+肢體缺血后處理+自噬激動(dòng)劑雷帕霉素組（Rapa組）和缺血再灌注+肢體缺血

3、后處理+自噬抑制劑3-MA組(3-MA組)。通過HE和TTC染色法觀察病理形態(tài)學(xué)變化和腦梗死體積;免疫組化和WB檢測(cè)LC3Ⅱ、Beclin1和Cathepsin B的蛋白表達(dá)和蛋白水平。
　　第二部分:JNK信號(hào)通路依賴的自噬參與肢體缺血后處理的作用機(jī)制:實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成Sham組、I/R組、LPostC組、缺血再灌注+肢體缺血后處理+JNK抑制劑sp600125組(sp6組)。WB檢測(cè)Beclin1、LC3Ⅱ和p-JNK的蛋白水

4、平。
　　第三部分:AMPK/mTOR依賴的自噬參與肢體缺血后處理的作用機(jī)制:實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成Sham組、I/R組、LPostC組、缺血再灌注+肢體缺血后處理+AMPK抑制劑compound C組(compound C組)。WB檢測(cè)Beclin1、LC3Ⅱ、p-AMPK和p-mTOR的蛋白水平。
　　研究結(jié)果:
　　第一部分:
　　1、HE染色結(jié)果:I/R組神經(jīng)元排列紊亂，許多神經(jīng)元核固縮深染，呈空泡狀改變。LP

5、ostC組病理學(xué)改變較I/R組輕。Rapa組病理學(xué)改變更輕，3-MA病理學(xué)改變重。
　　2、TTC染色結(jié)果:與I/R組相比，LPostC組梗死體積小(P＜0.05);與LPostC組相比，Rapa組梗死體積更小(P＜0.05)，而3-MA組梗死體積大(P＜0.05)。
　　3、免疫組化Beclin1和Cathepsin B蛋白表達(dá)結(jié)果:與Sham組相比，I/R組兩者的蛋白表達(dá)均增高(P＜0.05);與I/R組相比，LPost

6、C組蛋白表達(dá)均增高(P＜0.05);與LPostC組相比，Rapa組蛋白表達(dá)進(jìn)一步增高，3-MA組均降低(P＜0.05)。
　　4、WB檢測(cè)Beclin1、LC3Ⅱ和Cathepsin B蛋白水平結(jié)果:與Sham組相比，I/R組三者的蛋白水平均增高(P＜0.05);與I/R組相比，LPostC組蛋白水平均增高(P＜0.05);與LPostC組相比，Rapa組蛋白水平均進(jìn)一步增高，3-MA組均降低(P＜0.05)。
　　第二部

7、分:
　　1、Beclin1和LC3Ⅱ的蛋白水平結(jié)果:與Sham組相比，I/R組兩者的蛋白水平增高(P＜0.05);與I/R組相比，LPostC組蛋白水平更高(P＜0.05);與LPostC組相比，sp6組蛋白水平降低(P＜0.05)。
　　2、p-JNK的蛋白水平結(jié)果:與Sham組相比，I/R組蛋白水平增高(P＜0.05);與I/R組相比，LPostC組蛋白水平更高(P＜0.05);與LPostC組相比較，sp6組蛋白水平

8、降低(P＜0.05)。
　　第三部分:
　　1、Beclin1和LC3Ⅱ的蛋白水平結(jié)果:與Sham組相比，I/R組兩者的蛋白水平增高(P＜0.05);與I/R組相比，LPostC組蛋白水平更高(P＜0.05);與LPostC組相比，compound C組蛋白水平降低(P＜0.05)。
　　2、p-AMPK的蛋白水平結(jié)果:與Sham組相比，I/R組蛋白水平增高(P＜0.05);與I/R組相比，LPostC組蛋白水平更高(

9、P＜0.05);與LPostC組相比，compoundC組蛋白水平降低(P＜0.05)。
　　3、p-mTOR的蛋白水平結(jié)果:與Sham組相比，I/R組蛋白水平降低(P＜0.05);與I/R組相比，LPostC組蛋白水平更低(P＜0.05);與LPostC組相比，compoundC組蛋白水平升高(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　1.肢體缺血后處理通過激活自噬在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。
　　2.JNK