Annexin A2在非小細(xì)胞肺癌中選擇性表達(dá)并促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移.pdf

1、中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文AnnexinA2在非小細(xì)胞肺癌中選擇性表達(dá)并促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移姓名：官忠燕申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：韓昱晨20090301金橋生物技術(shù)有限公司。AnnexinA2siRNA(sc29199)購自SantaCruz公司，轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000reagent購自Invitrogen公司。2、實(shí)驗(yàn)方法(1)細(xì)胞培養(yǎng)(2)免疫組織化學(xué)(SP)法標(biāo)本經(jīng)中性福爾馬林固定，

2、常規(guī)石蠟包埋，4am厚連續(xù)切片，采用鏈霉素抗生物素蛋白過氧化物酶法(SP)，進(jìn)行免疫組化染色。DAB顯色。用PBS代替一抗作為陰性對照。(3)肺癌細(xì)胞系的免疫化學(xué)染色(SP)法細(xì)胞爬片后加入固定液固定，采用鏈霉素抗生物素蛋白過氧化物酶法(SP)，進(jìn)行免疫組化染色。DAB顯色，棕褐色反應(yīng)產(chǎn)物代表抗原定位。用PBS代替一抗作為陰性對照。(4)Westernblot提取細(xì)胞蛋白，采用卡瑪斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白，進(jìn)行SDSPAGE凝膠

3、電泳、轉(zhuǎn)印，一抗(antiAnnexinA21：300稀釋，antiBactinl：500稀釋)，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1：1500稀釋)室溫孵育，ECL發(fā)光，結(jié)果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀(Chemilmager5500，AlphaInnotech，USA)成像，F(xiàn)luorChenV20系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)。以8actin為內(nèi)對照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取算術(shù)平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。(5)SiRNA轉(zhuǎn)染傳代細(xì)胞LTE在培養(yǎng)瓶中生長2天后，傳至六孔板，跏l

4、AnnexinA2SiRNA與鯫lLip2000分別與100pl無雙抗無血清培養(yǎng)基混合后將AnnexinA2SiRNA與Lip2000溶液混合，再以1：5的比例與無雙抗無血清培養(yǎng)基混合，用無雙抗無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞洗兩次并將混合液加入孔板。轉(zhuǎn)染后6hJJIl入等體積含雙倍血清的培養(yǎng)基，24h后換正常培養(yǎng)基，培養(yǎng)3天后收集細(xì)胞，進(jìn)行檢測。(6)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)AnnexinA2SiRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后第3天，在約100％融合的單層細(xì)胞表面用高壓滅菌