Gankyrin通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制.pdf

1、背景：
　　肺癌是中國乃至全世界發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，其死亡率也居各種惡性腫瘤的首位，嚴(yán)重威脅著人類健康。其中非小細(xì)胞肺癌（Non-small cell lung cancer， NSCLC約占肺癌患者總數(shù)的80％。肺癌轉(zhuǎn)移是影響肺癌患者生存的最主要因素。但是目前有關(guān)肺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不清楚。只有對(duì)肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行深入研究，找到控制肺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因，對(duì)其進(jìn)行有效的抑制，才能有望從根本上控制肺癌的轉(zhuǎn)移，達(dá)到提高肺癌患者生存的

2、目的。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）是肺癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的起始和關(guān)鍵步驟；抑制肺癌 EMT，可有效控制肺癌的轉(zhuǎn)移。但是肺癌 EMT的調(diào)控機(jī)制尚不明了，亟需深入探索。
　　Gankyrin，又稱 p28GANK，是Fujita等人于2000年從人肝癌細(xì)胞中克隆出的新的候選癌基因。其蛋白由7個(gè)重復(fù)的ankyrin結(jié)構(gòu)域組成，可介導(dǎo)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。起初的

3、研究證實(shí)Gankyrin蛋白是26S蛋白酶體的重要組成部分，可通過與S6 ATPase、CDK4/6、MDM2等相互作用，促進(jìn)蛋白酶體對(duì)抑癌蛋白R(shí)b和 P53的降解。隨后的研究證實(shí)：Gankyrin除在肝癌組織中有高表達(dá)外，在其它多種癌組織中，如乳腺癌、結(jié)直腸癌、食管癌等中也檢測(cè)出高表達(dá)，并且被發(fā)現(xiàn)可不依賴于蛋白酶體而發(fā)揮促腫瘤作用。但是 Gankyrin癌基因及其表達(dá)產(chǎn)物在 NSCLC轉(zhuǎn)移及預(yù)后中的價(jià)值尚不清楚。
　　Ganky

4、rin作為高度保守的分子蛋白，是否可以通過誘導(dǎo) NSCLC發(fā)生 EMT，促進(jìn)轉(zhuǎn)移進(jìn)而影響肺癌患者預(yù)后？值得探索和證實(shí)。如果是，那么發(fā)揮作用的機(jī)制是什么？這也是值得深入研究的課題。Gankyrin若能在肺癌EMT過程發(fā)揮重要作用，并促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移，則有望成為控制肺癌轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)。
　　目的：
　　1、檢測(cè)Gankyrin在NSCLC組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況，并分析其與NSCLC患者臨床病理因素的關(guān)系。
　　2、探索Ganky

5、rin癌基因?qū)SCLC細(xì)胞體外遷移和侵襲能力的影響。
　　3、探索Gankyrin癌基因?qū)SCLC細(xì)胞EMT的影響，分析臨床組織標(biāo)本中EMT分子標(biāo)志物與Gankyrin蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性。
　　4、初步探討Gankyrin癌基因誘導(dǎo)肺癌EMT的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1、采用IHC方法檢測(cè)166對(duì)NSCLC患者癌組織及配對(duì)的正常肺組織標(biāo)本中Gankyrin蛋白表達(dá)情況；采用半定量PCR及Western bl

6、ot方法檢測(cè)24對(duì)新鮮NSCLC患者癌組織及配對(duì)正常肺組織標(biāo)本中 Gankyrin的mRNA和蛋白水平；采用卡方檢驗(yàn)分析Gankyrin蛋白表達(dá)與臨床病理資料的相關(guān)性；采用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線；采用COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型評(píng)估Gankyrin蛋白表達(dá)對(duì)NSCLC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。
　　2、采用定量PCR及Western blot方法檢測(cè)6種常見肺癌細(xì)胞珠中Gankyrin的mRNA和蛋白水平；對(duì)Gankyrin表達(dá)

7、相對(duì)較低的肺癌細(xì)胞珠進(jìn)行Gankyrin基因的過表達(dá)；而對(duì)Gankyrin表達(dá)相對(duì)較高的肺癌細(xì)胞珠進(jìn)行Gankyrin基因的沉默。采用電穿孔轉(zhuǎn)染法將攜帶有目的基因全長功能區(qū)序列的重組質(zhì)粒導(dǎo)入Gankyrin表達(dá)相對(duì)較低的肺癌細(xì)胞珠內(nèi)（腺癌和鱗癌各一株），并用G418800至400ug/ml的藥物濃度篩選并挑出單克隆，采用定量PCR及Western blot方法驗(yàn)證Gankyrin基因過表達(dá)肺癌細(xì)胞系是否構(gòu)建成功。同時(shí)采用由上海吉?jiǎng)P公司構(gòu)

8、建的攜帶有 Gankyrin干擾 RNA的慢病毒包裝顆粒感染Gankyrin表達(dá)相對(duì)較高的肺癌細(xì)胞珠，待感染效率達(dá)80-90%以上，采用PCR及Western blot方法驗(yàn)證Gankyrin基因沉默肺癌細(xì)胞系是否構(gòu)建成功。
　　3、采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)Gankyrin對(duì)NSCLC細(xì)胞體外遷移能力的影響；采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)Gankyrin對(duì)NSCLC細(xì)胞體外侵襲能力的影響。
　

9、　4、采用Western blot方法檢測(cè)Gankyrin基因過表達(dá)或干擾前后肺癌細(xì)胞EMT標(biāo)志物變化情況；同時(shí)采用細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè) Gankyrin被過表達(dá)或沉默前后EMT蛋白標(biāo)志物的熒光變化情況；并采用IHC方法檢測(cè)166例NSCLC患者癌組織中EMT標(biāo)志物蛋白表達(dá)情況，分析EMT標(biāo)志物與Gankyrin蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性。
　　5、采用Western blot、ELISA方法檢測(cè)Gankyrin對(duì)IL-6及下游關(guān)鍵信號(hào)分子

10、的影響；采用外源TGF-β及IL-6刺激肺癌細(xì)胞，Western blot方法檢測(cè)下游信號(hào)分子的變化，同時(shí)在加入分子抑制劑或用siRNA干擾后，檢測(cè)下游信號(hào)通路分子的變化情況。以此來初步探索Gankyrin誘導(dǎo)肺癌EMT的分子機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1、Gankyrin在NSCLC癌組織中表達(dá)率為78.3%，而在配對(duì)正常肺組織陽性率為28.9%；Gankyrin的過表達(dá)發(fā)生率為53.6%，而正常組織中只有4.8%；新鮮組織標(biāo)

11、本半定量PCR及Western blot檢測(cè)證實(shí)：癌組織中Gankyrin mRNA及蛋白水平均高于正常組織；Gankyrin蛋白的過表達(dá)和NSCLC患者的p-TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)；Gankyrin的過表達(dá)和NSCLC患者的預(yù)后差相關(guān)；Cox風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示：Gankyrin過表達(dá)是NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。
　　2、Gankyrin在常見肺癌細(xì)胞株中高表達(dá)，而在正常支氣管粘膜上皮細(xì)胞株中表達(dá)卻較低；各肺癌細(xì)胞

12、株之間相比，肺腺癌Sk-lu-1和肺鱗癌H520細(xì)胞株中Gankyrin表達(dá)相對(duì)較低，而肺腺癌H838和肺鱗癌Calu-1細(xì)胞株中Gankyrin表達(dá)相對(duì)較高；定量PCR及Western blot檢測(cè)顯示：pcDNA3.1-gankyrin組H520、Sk-lu-1細(xì)胞中的Gankyrin水平明顯高于 pcDNA3.1-control組細(xì)胞及空白對(duì)照組細(xì)胞；檢測(cè)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)：siRNA-gankyrin組H838、Calu-1細(xì)胞中的Ga

13、nkyrin表達(dá)水平明顯低于相應(yīng)的陰性病毒感染組細(xì)胞和空白對(duì)照組細(xì)胞。提示：Gankyrin高/低表達(dá)肺癌細(xì)胞系構(gòu)建成功。
　　3、沉默Calu-1和H838肺癌細(xì)胞株中Gankyrin基因水平后，細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力隨之降低；過表達(dá)肺癌Sk-lu-1和H520細(xì)胞株Gankyrin基因水平后，肺癌細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力也隨之增強(qiáng)。由此可見 Gankyrin促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力。
　　4、沉默Calu

14、-1和H838肺癌細(xì)胞株Gankyrin基因水平后，EMT標(biāo)志物E-cadherin蛋白水平升高，Vimentin和Twist1蛋白水平下降；過表達(dá)Sk-lu-1和H520肺癌細(xì)胞株 Gankyrin基因水平后，EMT標(biāo)志物 E-cadherin蛋白水平明顯降低， Vimentin和Twist1蛋白水平則升高；細(xì)胞免疫熒光試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)與Western blot檢測(cè)一致的結(jié)果。另外，我們對(duì)166例NSCLC患者組織標(biāo)本進(jìn)行了EMT標(biāo)志物的蛋

15、白表達(dá)檢測(cè)，并分析其與 Gankyrin蛋白表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示 Gankyrin蛋白表達(dá)與E-cadherin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而與Vimentin及Twist1蛋白表達(dá)成正相關(guān)。
　　5、Gankyrin過表達(dá)可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)、外IL-6水平；Gankyrin過表達(dá)可以激活I(lǐng)L-6信號(hào)通路下游分子STAT3，即上調(diào)p-STAT3，并促進(jìn)EMT；Gankyrin過表達(dá)可激活SMAD3，即上調(diào)p-SMAD3；而抑制p-STAT3，G

16、ankyrin上調(diào)的p-SMAD3水平降低；TGF-β刺激可提高肺癌細(xì)胞內(nèi) Gankyrin蛋白水平；而抑制 p-SMAD3水平，TGF-β刺激肺癌細(xì)胞后，Gankyrin蛋白水平不再升高。提示：Gankyrin通過介導(dǎo)形成SMAD3/Gankyrin/STAT3正反饋環(huán)來誘導(dǎo)肺癌EMT。
　　結(jié)論：
　　1、Gankyrin在NSCLC組織及細(xì)胞株中高表達(dá)，其過表達(dá)與NSCLC患者p-TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)；Ga