基于狂犬病病毒Leader序列熒光定量RT-PCR及其應(yīng)用.pdf

1、狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus，RABV)引起的一種古老的人獸共患病，以腦脊髓炎、狂躁不安及進(jìn)行性麻痹為主要特征，該病病死率為100％。近年來(lái)我國(guó)平均每年因狂犬病而死亡的人數(shù)約有2，000人，其中大多數(shù)是由犬、貓或野生動(dòng)物咬傷所致。動(dòng)物狂犬病的及時(shí)正確診斷對(duì)于疑似患者的暴露后治療及指導(dǎo)動(dòng)物狂犬病預(yù)防和控制具有重要意義。目前，用于動(dòng)物狂犬病診斷方法有多種，主要包括病毒直接觀察、病毒分離培養(yǎng)、病毒蛋白檢測(cè)及病毒基因檢測(cè)。病毒

2、直接觀察能夠直接觀察到病毒真實(shí)形態(tài)，但是需要在配備電鏡的專業(yè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行觀察;病毒的分離培養(yǎng)可獲得病毒，但是需要考慮生物安全及病毒對(duì)細(xì)胞和動(dòng)物的適應(yīng)性差異;病毒蛋白檢測(cè)是WHO和OIE共同推薦的最廣泛應(yīng)用的金標(biāo)準(zhǔn)診斷方法，但是需要標(biāo)準(zhǔn)化熒光標(biāo)記抗體、熒光顯微鏡與經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的操作人員，整個(gè)過(guò)程繁瑣且檢測(cè)敏感性低。傳統(tǒng)的狂犬病病毒基因檢測(cè)診斷方法包括普通RT-PCR和巢氏RT-PCR，但或敏感性差或耗時(shí)較長(zhǎng)且需接觸致癌染料。熒光定量RT-PCR

3、作為新興的狂犬病病毒基因診斷方法由于其敏感、快速、結(jié)果直觀的特性受到廣泛應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外已報(bào)道多種狂犬病病毒熒光定量RT-PCR方法，但在實(shí)際應(yīng)用定性診斷過(guò)程中:探針?lè)晒舛縍T-PCR背景信號(hào)強(qiáng)度高、擴(kuò)增曲線不典型、結(jié)果判定較困難等問(wèn)題時(shí)有發(fā)生;普通染料法熒光定量RT-PCR存在特異性差、假陽(yáng)性較多的缺點(diǎn)。因此，建立敏感特異的基于狂犬病病毒Leader序列熒光定量RT-PCR方法是解決我國(guó)動(dòng)物狂犬病診斷的重要途徑，也對(duì)公共衛(wèi)生具有一定意

4、義。
　　狂犬病病毒Leader序列熒光定量RT-PCR方法不僅可應(yīng)用于動(dòng)物狂犬病定性診斷，也可應(yīng)用于不同狂犬病病毒株精確定量。特別是在狂犬病病毒基礎(chǔ)研究中，傳統(tǒng)方法很難同時(shí)對(duì)街毒、固定毒和弱毒進(jìn)行定量，原因是:街毒對(duì)細(xì)胞適應(yīng)性差，無(wú)法通過(guò)TCID50對(duì)其進(jìn)行滴定;弱毒一般不會(huì)引起成年實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡，亦無(wú)法通過(guò)LD50對(duì)其進(jìn)行滴定。不同毒力狂犬病病毒精確定量的實(shí)現(xiàn)，則為狂犬病病毒致病機(jī)理及炎癥反應(yīng)研究奠定基礎(chǔ)。在病毒滴度確定基礎(chǔ)上，

5、探索不同毒力狂犬病病毒通過(guò)外周途徑感染但尚未進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)之前，血清中炎癥細(xì)胞因子的變化，對(duì)揭示狂犬病病毒感染研究具有重要意義，同時(shí)也為分子標(biāo)志物診斷研究提供參考。
　　鑒于我國(guó)狂犬病診斷及研究的需要，本研究進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):
　　1.基于狂犬病病毒基因組Leader序列熒光定量RT-PCR方法的建立。試驗(yàn)內(nèi)容:①對(duì)GenBank收錄的約200株狂犬病病毒全基因組進(jìn)行序列比對(duì)分析。②分別設(shè)計(jì)針對(duì)RABV基因組起始端Leader

6、序列的反轉(zhuǎn)錄單引物與針對(duì)RABV核蛋白基因保守區(qū)域的擴(kuò)增引物。③構(gòu)建包含有RABV街毒株BD06全長(zhǎng)核蛋白基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒并進(jìn)行系列梯度稀釋，以此建立熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。④利用數(shù)種不同宿主來(lái)源的細(xì)胞、非RABV病毒與陰性腦組織，進(jìn)行熒光定量RT-PCR特異性試驗(yàn)與敏感性試驗(yàn)。
　　2.基于狂犬病病毒Leader序列熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的組裝與在臨床樣品檢測(cè)中的應(yīng)用。試驗(yàn)內(nèi)容:①檢測(cè)試劑盒的操作過(guò)程優(yōu)化，即將部分試劑預(yù)混并將整

7、個(gè)檢測(cè)過(guò)程操作時(shí)間縮短至兩小時(shí)。②檢測(cè)試劑盒初步組裝，將檢測(cè)試劑盒各種組分按每盒40頭份進(jìn)行配制并撰寫使用說(shuō)明書。③對(duì)來(lái)自我國(guó)江西地區(qū)210份鼬獾臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。
　　3.狂犬病病毒街毒、弱毒分別感染的小鼠血清炎癥細(xì)胞因子的比較研究。試驗(yàn)內(nèi)容:①利用狂犬病病毒Leader序列熒光定量RT-PCR，對(duì)狂犬病病毒街毒株BD06與弱毒株SRV9感染的3日齡乳鼠發(fā)病后腦組織內(nèi)病毒基因組拷貝數(shù)進(jìn)行定量。②分別使用含有相同基因組拷貝數(shù)的狂犬

8、病病毒街毒株與弱毒株乳鼠腦組織毒，通過(guò)外周肌肉注射途徑感染BALB/c小鼠。③利用瑞博奧炎癥因子芯片對(duì)感染后第一天與第二天血清炎癥細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)。
　　通過(guò)以上試驗(yàn)，獲得以下結(jié)果:
　　1.通過(guò)狂犬病病毒全基因組序列比對(duì)并參考文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)一條針對(duì)狂犬病病毒全基因組Leader序列(而非mRNA或反基因組RNA)的反轉(zhuǎn)錄引物與一對(duì)針對(duì)核蛋白基因的擴(kuò)增引物。通過(guò)三條引物的使用以及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒的應(yīng)用，建立符合有效性的熒光定量RT-

9、PCR。該方法具有良好的特異性與敏感性。
　　2.實(shí)現(xiàn)了狂犬病病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)過(guò)程的優(yōu)化，檢測(cè)過(guò)程用時(shí)低于以往基因檢測(cè)技術(shù)，并完成了檢測(cè)試劑盒的初步組裝與使用說(shuō)明書的撰寫。對(duì)210份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出4份陽(yáng)性樣品。所檢出陽(yáng)性樣品與免疫熒光檢測(cè)（FAT）結(jié)果相符。
　　3.發(fā)現(xiàn)同一基因組拷貝數(shù)的狂犬病病毒街毒株或弱毒株引起宿主的不同炎癥應(yīng)答。在感染1天后，街毒株感染小鼠血清中4種炎癥因子水平均高于弱毒株且呈顯著

10、性差異，即街毒可引起更為嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。
　　綜合以上結(jié)果，得出以下結(jié)論:
　　1.建立一種具有良好特異性與敏感性的基于狂犬病病毒Leader序列熒光定量RT-PCR方法，即滿足定性診斷需要也可應(yīng)用于定量分析，具有良好的臨床診斷應(yīng)用前景。
　　2.初步組裝出狂犬病病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，經(jīng)210份鼬獾樣品檢測(cè)試驗(yàn)證明，檢測(cè)結(jié)果與國(guó)際金標(biāo)準(zhǔn)FAT一致，診斷效果確實(shí)可靠。
　　3.等量基因組拷貝數(shù)的不同病毒外

11、周感染發(fā)現(xiàn)，街毒引起更劇烈的炎癥反應(yīng)，且IL-1α、IL-2、IL-5與IFN-γ變化顯著。該研究為狂犬病分子標(biāo)志物診斷提供參考。
　　論文創(chuàng)新點(diǎn):
　　1.首次使用在整個(gè)狂犬病毒屬內(nèi)均高度保守的部分簡(jiǎn)并的Leader序列反轉(zhuǎn)錄單引物以獲得單股負(fù)鏈病毒基因組cDNA，以此增強(qiáng)了下游試驗(yàn)的特異性與敏感性。本研究實(shí)踐為整個(gè)負(fù)股單鏈RNA病毒的熒光定量RT-PCR研究提供新思路。
　　2.國(guó)內(nèi)首次建立基于狂犬病病毒基因組cD