鹽酸小檗堿對(duì)草魚補(bǔ)體C3作用機(jī)理及藥代動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、近年來(lái)，免疫學(xué)在水產(chǎn)上的研究已成為研究水產(chǎn)動(dòng)物病害的熱點(diǎn)之一，免疫機(jī)制的研究為合理有效地防治各類動(dòng)物疾病提供依據(jù)。傳統(tǒng)的預(yù)防與治療水產(chǎn)動(dòng)物疾病以使用抗生素為主，但不良反應(yīng)多，副作用顯著。然而人們發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的中藥不僅具有良好的抗菌和提供免疫力的作用而且副作用少。黃連具有清熱解毒及殺菌的功效，其主要化學(xué)成分是生物堿，例如，小檗堿、黃連堿、巴馬汀、表小檗堿、藥根堿，其中小檗堿含量約6％-10%。已有文獻(xiàn)報(bào)道黃連可以提高魚類的免疫力，因此，我

2、們對(duì)黃連生物堿進(jìn)行提取與分離并研究小檗堿對(duì)草魚補(bǔ)體C3作用的機(jī)理研究，闡明黃連提高水產(chǎn)類動(dòng)物免疫力的物質(zhì)基礎(chǔ)，為黃連在水產(chǎn)上的應(yīng)用與開發(fā)提供理論依據(jù)
　　本論文的主要內(nèi)容與結(jié)果
　　1、黃連中生物堿的提取分離與鑒定
　　運(yùn)用高速逆流色譜法（HSCCC），以氯仿-甲醇-0.2mol/L鹽酸作為溶劑體系從黃連的生物堿粗提物中進(jìn)一步分離制備了4種生物堿類化合物，通過(guò)1H NMR和13C NMR核磁波譜技術(shù)并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道確

3、定4個(gè)化合物分別為小檗堿、巴馬汀、表小檗堿及黃連堿。與傳統(tǒng)的分離方法相比，高速逆流色譜法（HSCCC）具有分離周期短，溶劑用量少，操作簡(jiǎn)便快捷，在中藥成分分離上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。
　　2、鹽酸小檗堿對(duì)感染嗜水氣單胞菌草魚存活率的影響
　　實(shí)驗(yàn)取體重均勻且健康的草魚150條，隨機(jī)分為5組：對(duì)照組（NC)、模型組（M）、鹽酸小檗堿0.06%組（BBR-L）、鹽酸小檗堿0.12%組（BBR-M）、鹽酸小檗堿0.24%組(BBR-H)

4、。實(shí)驗(yàn)組投喂相應(yīng)的濃度的鹽酸小檗堿飼料，對(duì)照組與模型組投喂基礎(chǔ)飼料，每天投喂飼料10g/尾，連續(xù)投喂14天后，模型組和實(shí)驗(yàn)組腹腔注射0.2mL嗜水氣單胞菌(108cfu/mL)，對(duì)照組注射等量的無(wú)菌生理鹽水。記錄草魚死亡情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取三次實(shí)驗(yàn)的平均值。結(jié)果顯示給藥組草魚的存活率分別為50%、70%、73.3%，模型組(M)存活率僅為10%，對(duì)照組沒(méi)有死亡情況。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，各個(gè)藥物濃度試驗(yàn)組草魚存活率均顯著提高(P<0.01)。表

5、明鹽酸小檗堿能提高草魚的免疫力，且與劑量相關(guān)。
　　3、鹽酸小檗堿對(duì)草魚非特異性免疫指標(biāo)的影響
　　本實(shí)驗(yàn)取80條體型大小相似的草魚隨機(jī)分為4組，每組20條，分別為對(duì)照組（NC)、0.06%、0.12%、0.24%鹽酸小檗堿給藥組，給藥組投喂相應(yīng)的濃度的鹽酸小檗堿飼料，對(duì)照組投喂基礎(chǔ)飼料。各組每天投喂飼料10g/尾，觀察草魚進(jìn)食和活動(dòng)情況，在第7天和第14天尾靜脈取血，測(cè)定草魚免疫指標(biāo)補(bǔ)體C3含量、溶菌酶活性、呼吸爆發(fā)活性。

6、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析及LSD對(duì)樣品進(jìn)行多重比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在第七天，0.12%和0.24%鹽酸小檗堿給藥組血清中補(bǔ)體C3含量與對(duì)照組相比顯著性提高（P<0.05），溶菌酶活性和呼吸爆發(fā)活性均有所上升，但未見(jiàn)顯著性差異（P>0.05）；第14天，各濃度給藥組的草魚補(bǔ)體C3含量均表現(xiàn)顯著性提高（P<0.05）；溶菌酶活性升高，但均未達(dá)顯著差異（P>0.05）；0.12

7、%、0.24%鹽酸小檗堿給藥組呼吸爆發(fā)活性升高且具有顯著性差異（P<0.05），0.06%鹽酸小檗堿給藥組活性雖有升高，但未見(jiàn)顯著差異（P>0.05）。表明鹽酸小檗堿能提高草魚的非特異性免疫功能。
　　4、鹽酸小檗堿對(duì)草魚補(bǔ)體C3 mRNA表達(dá)的影響
　　隨機(jī)將80條健康且體型大小相似的草魚分為4組，分別為對(duì)照組、0.06%、0.12%、0.24%鹽酸小檗堿給藥組。試驗(yàn)組投喂相應(yīng)的濃度的鹽酸小檗堿飼料，對(duì)照組投喂基礎(chǔ)飼料，每

8、天投喂飼料10g/尾。觀察草魚進(jìn)食情況和活動(dòng)情況，喂養(yǎng)14天后，麻醉后殺死，取其肝臟，提取草魚肝臟補(bǔ)體C3 mRNA，利用Primer5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，采用10μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成cDNA，用核酸定量?jī)x測(cè)定RNA濃度。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析及LSD對(duì)樣品進(jìn)行多重比較。PCR結(jié)果顯示，0.06%、0.12%、0.24%鹽酸小檗堿給藥組補(bǔ)體C3 mRNA表達(dá)均上調(diào)，

9、與對(duì)照組比較，各給藥組補(bǔ)體C3 mRNA表達(dá)上調(diào)比例分別為20.57%、27.35%、26.49%，具有顯著性差異（P<0.05），上調(diào)的趨勢(shì)與血清中補(bǔ)體C3的結(jié)果類似。研究表明鹽酸小檗堿能上調(diào)草魚補(bǔ)體C3 mRNA的表達(dá)。
　　5、補(bǔ)體消耗試驗(yàn)
　　草魚空白血清中加入鹽酸小檗堿配制成2mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L，80mg/L的鹽酸小檗堿血清溶液，進(jìn)行補(bǔ)體消耗試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

10、明：鹽酸小檗堿在血清中濃度達(dá)到5mg/L，可以激活補(bǔ)體C3，但未達(dá)顯著水平。當(dāng)鹽酸小檗堿濃度達(dá)到10mg/L，激活作用達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。表明高濃度的鹽酸小檗堿通過(guò)與補(bǔ)體C3的結(jié)合改變補(bǔ)體C3的構(gòu)型從而激活補(bǔ)體C3，激活程度呈劑量依賴關(guān)系。
　　6、草魚體內(nèi)鹽酸小檗堿藥代動(dòng)力學(xué)研究
　　取健康草魚72條（500±10g），按48mg/kg魚體重灌服鹽酸小檗堿（5mg/mL），分別在0.5h、1h、1.5h、2h、3