IBD VP2 DNA疫苗及雞Akirin2和GM-CSF對(duì)其免疫調(diào)節(jié)效果的研究.pdf

1、Akirins是天然免疫信號(hào)通路TLR所必須的核蛋白，調(diào)控依賴(lài)NF-κB的基因轉(zhuǎn)錄，在免疫和炎癥反應(yīng)中不可或缺，是極具潛力的免疫增強(qiáng)基因。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）是新一代分子免疫佐劑，能活化樹(shù)突狀細(xì)胞，增強(qiáng)其抗原遞呈能力，提高機(jī)體免疫應(yīng)答水平。傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease vir

2、us，IBDV）VP2基因編碼病原的主要結(jié)構(gòu)和抗原蛋白VP2，是研制IBD DNA疫苗的重要靶基因。本試驗(yàn)優(yōu)化合成了雞（Gallus）Akirin2和GM-CSF基因，研究了它們對(duì)IBD VP2 DNA疫苗的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值和應(yīng)用前景，主要研究?jī)?nèi)容包括：
　　1.參照GeneBank已發(fā)表的IBDV VP2（AF508177）、Gallus Akirin2（NM_001193595）和Gallus GM-CSF（E

3、U939770.1）基因序列，優(yōu)化合成三者編碼區(qū)核苷酸序列，利用連接肽串聯(lián)后克隆至 pTriEx-4，構(gòu)建 VP2、Akirin2和 GM-CSF三表達(dá)重組質(zhì)粒pVP2-Akirin2-GM-CSF。體外轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，48 h后通過(guò)SDS-PAGE和Western blot技術(shù)可檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)，大小分別為58 kDa、36kDa和22 kDa左右，證明該重組質(zhì)?？梢杂米鱀NA疫苗免疫。試驗(yàn)中同時(shí)成功構(gòu)建五種對(duì)照重組

4、質(zhì)粒：pVP2、pAkirin2、pGM-CSF、pVP2-Akirin2和pVP2-GM-CSF。
　　2.將pVP2重組質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)移載體與BacMagic-3 DNA構(gòu)建重組桿狀病毒Bac-VP2，感染Sf9細(xì)胞后以IBD標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清作為一抗進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，能夠檢測(cè)到特異性熒光。大量提取蛋白并經(jīng)鎳柱親和層析，作為抗原包被酶標(biāo)板制備VP2抗體ELISA檢測(cè)方法，經(jīng)IBD標(biāo)準(zhǔn)血清檢測(cè)，證明其靈敏性、重復(fù)性良好；經(jīng)雞馬立克（M

5、D）、禽白血?。ˋL）、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥（RE）、禽流感（AI）、雞新城疫（ND）陽(yáng)性血清檢測(cè)，證明其特異性良好。
　　3.將pVP2-Akirin2-GM-CSF重組質(zhì)粒作為DNA疫苗免疫14日齡SPF雞，28日齡加強(qiáng)免疫，42日齡以IBDV BC6-85強(qiáng)毒株攻擊，攻毒96 h后剖檢，統(tǒng)計(jì)得疫苗保護(hù)率為85％，高于pVP2組（55%）、pVP2-Akirin2組（75%）和pVP2-GM-CSF組（70%）。分別于14日齡

6、、28日齡、42日齡和46日齡翅下靜脈采血檢測(cè)血清VP2抗體和中和抗體水平。結(jié)果顯示，隨著免疫次數(shù)和時(shí)間的增加，pVP2-Akirin2-GM-CSF組VP2抗體水平和中和抗體滴度均持續(xù)上升，42日齡時(shí)，VP2抗體水平（S/P）值達(dá)到1.016，均高于pVP2組（S/P=0.771，p＜0.01)、pVP2-Akirin2組（S/P=0.973，p＞0.05)和pVP2-GM-CSF組（S/P=0.836，p＜0.01)；IBDV中和抗

7、體滴度達(dá)到1:4298，極顯著高于 pVP2組（1:2057，p＜0.01）、pVP2-Akirin2組（1:3514，p＜0.01）和pVP2-GM-CSF組（1:2557，p＜0.01)。MTT法檢測(cè)42日齡時(shí)外周血淋巴細(xì)胞增殖能力，pVP2-Akirin2-GM-CSF誘導(dǎo)的增殖指數(shù)均顯著高于其余各重組質(zhì)粒組（p＜0.05)。ELISA檢測(cè)42日齡pVP2-Akirin2-GM-CSF組試驗(yàn)雞血清IFN-γ、IL-2、IL-4和I