原位PCR檢測(cè)定位豫醫(yī)無(wú)毛小鼠無(wú)毛基因.pdf

1、鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文原位PCR檢測(cè)定位豫醫(yī)無(wú)毛小鼠無(wú)毛基因姓名：軒小燕申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：免疫學(xué)指導(dǎo)教師：杜獻(xiàn)堂20020101原位PCR檢測(cè)定位豫醫(yī)無(wú)毛小鼠無(wú)毛基因似的突變株無(wú)毛基因全序列設(shè)計(jì)引物。應(yīng)用原位PCR的方法，檢測(cè)定位豫醫(yī)無(wú)毛小鼠胸腺、脾組織切片和骨髓細(xì)胞、淋巴細(xì)胞內(nèi)的無(wú)毛基因。確定豫醫(yī)無(wú)毛小鼠與其他得到國(guó)際公認(rèn)的無(wú)毛小鼠，如：rhinomice，hairlessmice等基因結(jié)構(gòu)方面的同源性。結(jié)果1石蠟組織切片上突變基

2、因的獲得：利用基因文庫(kù)中的無(wú)毛基因全序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，即引物P，和P，。引物5、端用生物素標(biāo)記。應(yīng)用豫醫(yī)無(wú)毛小鼠的胸腺、脾做石蠟組織切片，正常昆明小鼠的胸腺、脾的組織所做石蠟組織切片作為對(duì)照。應(yīng)用蛋白酶K改變石蠟切片上組織的通透性，用多聚甲醛固定組織，乙醇水化。熱啟動(dòng)：在PCR擴(kuò)增前，部分PCR反應(yīng)混合液(不加TaqDNA多聚酶)94℃預(yù)熱5min，然后再加入TaqDNA多聚酶。每張玻片上加40uLPCR反應(yīng)液，蓋上蓋玻片，液體石蠟封片

3、。于94℃熱板上變性5min，50℃復(fù)性10rain，72℃延伸10min；共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。對(duì)照：正常昆明小鼠的石蠟切片；豫醫(yī)無(wú)毛小鼠石蠟組織切片不加引物對(duì)照和不加TaqDNA聚合酶的對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后三氯甲烷，酶學(xué)方法檢測(cè)雜交信號(hào)，在顯微鏡觀察結(jié)果并記錄。確定有雜交信號(hào)吸附在組織上。2染色體標(biāo)本的獲得：用戊巴比妥鈉麻醉豫醫(yī)無(wú)毛小鼠和正常的昆明小鼠實(shí)驗(yàn)群。腹部酒精消毒，置超凈臺(tái)中，取心臟血大約lml，用淋巴細(xì)胞分離液分離，PBS沖洗數(shù)次