瘦素對角質(zhì)形成細(xì)胞增殖分化角蛋白的影響及其分子信號通路的研究.pdf

1、銀屑病是臨床上常見的慢性炎癥性皮膚病,由T細(xì)胞(Th細(xì)胞)協(xié)同角質(zhì)形成細(xì)胞(Keratinocyte,KC)過度增殖性為特征,其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明,可能是由一系列因素相互作用的多基因遺傳疾病,包括遺傳因素、免疫因素、環(huán)境因素、肥胖等。
　　近來臨床觀察研究發(fā)現(xiàn),銀屑病伴發(fā)肥胖的比例增高,針對肥胖治療后有助于銀屑病好轉(zhuǎn),提示肥胖與銀屑病密切相關(guān)。瘦素是參與機(jī)體代謝的脂肪因子,以往研究表明瘦素與其受體在銀屑病皮損中高表達(dá),瘦素可

2、能與銀屑病的表皮過度增殖相關(guān),提示瘦素可能為銀屑病與肥胖的內(nèi)在重要分子聯(lián)系。
　　在正常皮膚中,KC分化相關(guān)性角蛋白K1和K10占主導(dǎo)地位,增殖相關(guān)性角蛋白K16和K17幾乎不表達(dá)或者少量表達(dá),而在銀屑病皮損中,KC角蛋白譜發(fā)生一定的改變,K16和K17在皮損處高表達(dá),且與PASI呈正相關(guān)關(guān)系,而 K1和K10則低表達(dá)。
　　我們前期研究發(fā)現(xiàn),瘦素在銀屑病患者皮損中過度表達(dá),且瘦素對KC活性及細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖均產(chǎn)生影響,并

3、能刺激KC產(chǎn)生銀屑病相關(guān)炎癥因子,包括IL-6、IL-8、TNF-α等,以上研究結(jié)果表明瘦素參與了銀屑病表皮過度增殖的病理生理過程,但瘦素在銀屑病病理生理過程中的作用尚不明確。
　　目的：
　　本研究的目的在于通過觀察瘦素對KC角蛋白(K1、K10,K16、K17)表達(dá)的影響及其分子調(diào)控為進(jìn)一步闡明瘦素影響KC增殖在銀屑病發(fā)病機(jī)制中奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞,用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(R

4、eal-time PCR)、蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)和細(xì)胞免疫熒光染色分別檢測K1、K10、K16、K17 mRNA和蛋白水平的表達(dá),采用Western blot篩選瘦素處理后可能出現(xiàn)的信號通路分子改變,并用相應(yīng)的通路抑制劑和siRNA處理證實(shí)瘦素調(diào)控角蛋白表達(dá)的信號通路。
　　結(jié)果：
　　1、瘦素對HaCaT細(xì)胞增殖分化角蛋白表達(dá)的影響:1)mRNA結(jié)果:與陰性對照組比較,瘦素組K1、K10 mRNA表

5、達(dá)量下調(diào),K16、K17 mRNA均出現(xiàn)不同程度的升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且濃度為100ng/mL瘦素組K16、K17 mRNA上調(diào)顯著;2)蛋白結(jié)果:與陰性對照組相比較,瘦素組K1、K10蛋白表達(dá)量降低,K16、K17蛋白均出現(xiàn)不同程度的升高,且濃度為100ng/mL瘦素組K16、K17蛋白顯著增加;3)免疫熒光結(jié)果:瘦素組紅色熒光K16、K17表達(dá)與陰性對照組相比顯著增加,而K1、K10紅色熒光表達(dá)明顯降低,與RT

6、-PCR、Western blot結(jié)果相符。
　　2、瘦素調(diào)控HaCaT細(xì)胞分子信號通路:用100ng/mL瘦素分別刺激HaCaT細(xì)胞5min、10min、20min、40min、80min,發(fā)現(xiàn)瘦素可以激活 JAK-STAT3、ERK1/2分子信號通路。
　　3、分子信號通路抑制劑對瘦素調(diào)控 HaCaT細(xì)胞增殖分化角蛋白的影響:1) mRNA結(jié)果:與單純使用瘦素組相比較,抑制劑和瘦素聯(lián)合處理組K1、K10、K16、K17

7、mRNA顯著下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);2)蛋白結(jié)果:與單純使用瘦素組相比較,抑制劑和瘦素聯(lián)合處理組K1、K10、K16、K17蛋白顯著降低;3)免疫熒光結(jié)果:抑制劑和瘦素聯(lián)合處理組 K1、K10、K16、K17表達(dá)的紅色熒光較瘦素組明顯減弱,與RT-PCR、Western blot結(jié)果相符。
　　4.、進(jìn)一步驗(yàn)證分子信號通路siRNA對瘦素調(diào)控HaCaT細(xì)胞增殖角蛋白的影響:1)mRNA結(jié)果:siRNA和瘦素聯(lián)合處

8、理組與單純使用瘦素組相比較K16、K17 mRNA顯著下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);2)蛋白結(jié)果:siRNA成功阻斷STAT3、ERK1/2分子通路,且K16、K17蛋白明顯低于瘦素組。
　　結(jié)論：
　　本研究證明瘦素可以誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞高表達(dá)K16、K17,低表達(dá)K1、K10,其機(jī)制可能與STAT3、ERK1/2分子信號通路有關(guān),表明瘦素可影響銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖,抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的分化,提示瘦素可能通過