2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  本研究擬回答以下問題:角質形成細胞經過44℃溫熱處理后,是否產生特異性高表達的HSPs?特異性增高的HSPs又能引起哪些分子的改變?溫熱影響下,這些變化的分子通過何種途徑作用于角質形成細胞?
  方法:
  一、實驗對象
  細胞系選擇為人角質形成細胞系(HaCaT),購于江蘇凱基生物技術股份有限公司。受試者為2013年1月至2014年6月于中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科門診診斷為跖疣的患者,符合臨床

2、診斷標準,經本人或其監(jiān)護人知情同意,入組衛(wèi)生公益性行業(yè)研究專項經費(201202013)項目,自愿接受溫熱治療。獲得中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會的批準,并符合赫爾辛基宣言。
  二、溫熱處理方案
  1、儀器
  采用紅外溫熱儀(專利號:ZL200720185403.3,中國醫(yī)科大學),光源為鎢鹵素燈(90%以上的波長為760-2300nm,波峰為1200nm),采取非接觸式定點加熱,通過紅外體溫監(jiān)測儀實時反饋體

3、表溫度,使溫度恒定。
  2、細胞溫熱
  采用水浴加熱的方式溫熱30分鐘,37℃為對照組,44℃為實驗組。根據實驗需要收集溫熱后不同時間點的細胞。
  3、在體溫熱
  選取靶皮損進行局部溫熱治療。第一階段治療為連續(xù)3天,每天30分鐘,溫度為44℃。10天后進行第二階段治療,連續(xù)2天,每天30分鐘,溫度為44℃。隨訪觀察6個月,觀察治療效果。
  三、實時熒光定量PCR檢測溫熱后HSPs的時相性變化

4、>  分別收集對照組(37℃)和實驗組(44℃)溫熱處理前及溫熱后培養(yǎng)1h、2h、4h、12h的HaCaT細胞,用Qiagen公司的miRNeasy Mini Kit試劑盒提取RNA,逆轉錄得到cDNA,以HSPA6(HSP70家族成員)、HSP90為引物行real-time PCR檢測。
  四、PCR Array方法篩選溫熱相關的特異生HSPs
  收集44℃溫熱處理前,及溫熱后培養(yǎng)2小時的HaCaT細胞,提取RNA,逆

5、轉錄后行PCR Array檢測,篩選出特異性表達的HSPs。
  五、利用CRISPR/Cas9技術、慢病毒為載體建立DNAJA4基因敲除細胞
  采用CRISPR/Cas9技術、慢病毒為載體分別轉入Cas9及gRNA基因,利用流式細胞術、熒光顯微鏡觀察、基因測序、western blot的方法對建立的可穩(wěn)定傳代細胞進行驗證。
  六、基因表達譜差異分析方法探討DNAJA4基因敲除后引起的相關分子的變化
  分別

6、收集溫熱處理前及溫熱后培養(yǎng)2h、18h及36h的空載體及基因敲除細胞送檢,利用表達譜差異分析的方法尋找變化的基因,通過相關通路的對比分析,尋找與DNAJA4關系密切的基因,并用real-time PCR的方法驗證相關基因的變化。
  七、流式細胞術檢測DNAJA4基因對細胞周期的影響
  收集37℃培養(yǎng)的HaCaT、空載體及基因敲除細胞,及溫熱后培養(yǎng)36h的空載體及基因敲除細胞,利用流式細胞術檢測細胞周期,分別比較G0/G1

7、期、S期、G2/M期的百分比。
  八、統(tǒng)計學分析
  利用GraphPad Prism5軟件對資料進行統(tǒng)計學分析及圖表的繪制,組間比較用t檢驗及方差分析,p<0.05時認為差異有統(tǒng)計學意義。
  結果:
  一、溫熱干預下角質形成細胞差異表達的熱休克蛋白及其時相性變化
  1、44℃溫熱處理后,HSPA6、HSP90在mRNA水平迅速升高
  角質形成細胞經溫熱處理后,HSPA6、HSP90的表達量

8、逐漸升高。與溫熱后即刻相比,HSPA6從2小時起開始出現差異性高表達,4小時后表達量達到最高并開始降低;HSP90在4小時出現差異性高表達,隨后達到最高并開始降低。
  2、通過PCR Array的方法發(fā)現8個HSPs出現差異性高表達
  從80余種熱休克蛋白中篩選發(fā)現:溫熱后,DNAJA4、DNAJB1、CRYAB、BAG3、HSPA6、HSPA1A、HSPA1B及HSPA1L在角質形成細胞中發(fā)生8倍以上的高表達;12個基

9、因出現2-6倍的上調;余下基因的變化在0.5-2倍之間。
  3、溫熱使角質形成細胞的DNAJA4在蛋白水平上表達增高
  溫熱后2小時,HaCaT細胞系中DNAJA4基因在蛋白水平上表達開始增高。
  二、構建DNAJA4基因敲除角質形成細胞
  以慢病毒為載體,分別轉入Cas9及gRNA基因,經多種方法驗證:熒光顯微鏡觀察及流式細胞術顯示90%以上慢病毒載體成功轉入HaCaT細胞中;并且在基因及蛋白水平上成功

10、敲除DNAJA4基因。
  三、DNAJA4基因影響角質形成細胞中NF-κB通路的IL-1β途徑多個分子表達水平
  1、基因表達譜差異分析結果
  基因表達譜差異分析方法共鑒定22017種基因,溫熱后培養(yǎng)2小時及18小時的細胞中,DNAJA4的敲除分別僅引起7個及10個基因發(fā)生差異性變化;培養(yǎng)36小時的細胞中,DNAJA4的敲除可引起50個基因表達下降,45個基因表達增高。經生物信息學分析提示,IL-1β參與其中多條

11、通路,與感染性疾病密切相關,值得進一步深入研究。
  2、DNAJA4基因敲除后,NF-κB通路中多個基因表達降低
  對比溫熱處理36小時后空載體及基因敲除細胞發(fā)現: DNAJA4基因敲除后,IL-1β、IL-1R1、IRAK1、NFKBIA、P50及P65在RNA水平均表達下降,降低幅度為0.3-0.5倍;P65的S276位點磷酸化蛋白表達下降。
  3、DNAJA4基因敲除后,細胞周期中G1期比例降低,G2/M期

12、比例增高
  對比溫熱處理后培養(yǎng)36小時的空載體及基因敲除細胞發(fā)現:DNAJA4基因敲除后,DNAJA4基因敲除細胞的S、G2期比率升高約5個百分點。
  結論:
  1、溫熱處理角質形成細胞系HaCaT細胞后,DNAJA4、HSPA6及HSP90等8個熱休克蛋白發(fā)生8倍以上的高表達;12個基因出現2-6倍的上調,其余熱休克蛋白未發(fā)生顯著性變化。
  2、DNAJA4基因敲除后,NF-κB通路的IL-1β途徑中多

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