溫熱對角質(zhì)形成細胞熱休克蛋白的影響.pdf

1、目的：
　　本研究擬回答以下問題:角質(zhì)形成細胞經(jīng)過44℃溫熱處理后，是否產(chǎn)生特異性高表達的HSPs?特異性增高的HSPs又能引起哪些分子的改變？溫熱影響下，這些變化的分子通過何種途徑作用于角質(zhì)形成細胞？
　　方法：
　　一、實驗對象
　　細胞系選擇為人角質(zhì)形成細胞系(HaCaT)，購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。受試者為2013年1月至2014年6月于中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科門診診斷為跖疣的患者，符合臨床

2、診斷標準，經(jīng)本人或其監(jiān)護人知情同意，入組衛(wèi)生公益性行業(yè)研究專項經(jīng)費(201202013)項目，自愿接受溫熱治療。獲得中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會的批準，并符合赫爾辛基宣言。
　　二、溫熱處理方案
　　1、儀器
　　采用紅外溫熱儀（專利號:ZL200720185403.3，中國醫(yī)科大學），光源為鎢鹵素燈(90％以上的波長為760-2300nm，波峰為1200nm)，采取非接觸式定點加熱，通過紅外體溫監(jiān)測儀實時反饋體

3、表溫度，使溫度恒定。
　　2、細胞溫熱
　　采用水浴加熱的方式溫熱30分鐘，37℃為對照組，44℃為實驗組。根據(jù)實驗需要收集溫熱后不同時間點的細胞。
　　3、在體溫熱
　　選取靶皮損進行局部溫熱治療。第一階段治療為連續(xù)3天，每天30分鐘，溫度為44℃。10天后進行第二階段治療，連續(xù)2天，每天30分鐘，溫度為44℃。隨訪觀察6個月，觀察治療效果。
　　三、實時熒光定量PCR檢測溫熱后HSPs的時相性變化

4、>　　分別收集對照組(37℃)和實驗組(44℃)溫熱處理前及溫熱后培養(yǎng)1h、2h、4h、12h的HaCaT細胞，用Qiagen公司的miRNeasy Mini Kit試劑盒提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以HSPA6（HSP70家族成員）、HSP90為引物行real-time PCR檢測。
　　四、PCR Array方法篩選溫熱相關(guān)的特異生HSPs
　　收集44℃溫熱處理前，及溫熱后培養(yǎng)2小時的HaCaT細胞，提取RNA，逆

5、轉(zhuǎn)錄后行PCR Array檢測，篩選出特異性表達的HSPs。
　　五、利用CRISPR/Cas9技術(shù)、慢病毒為載體建立DNAJA4基因敲除細胞
　　采用CRISPR/Cas9技術(shù)、慢病毒為載體分別轉(zhuǎn)入Cas9及gRNA基因，利用流式細胞術(shù)、熒光顯微鏡觀察、基因測序、western blot的方法對建立的可穩(wěn)定傳代細胞進行驗證。
　　六、基因表達譜差異分析方法探討DNAJA4基因敲除后引起的相關(guān)分子的變化
　　分別

6、收集溫熱處理前及溫熱后培養(yǎng)2h、18h及36h的空載體及基因敲除細胞送檢，利用表達譜差異分析的方法尋找變化的基因，通過相關(guān)通路的對比分析，尋找與DNAJA4關(guān)系密切的基因，并用real-time PCR的方法驗證相關(guān)基因的變化。
　　七、流式細胞術(shù)檢測DNAJA4基因?qū)毎芷诘挠绊?br>　　收集37℃培養(yǎng)的HaCaT、空載體及基因敲除細胞，及溫熱后培養(yǎng)36h的空載體及基因敲除細胞，利用流式細胞術(shù)檢測細胞周期，分別比較G0/G1

7、期、S期、G2/M期的百分比。
　　八、統(tǒng)計學分析
　　利用GraphPad Prism5軟件對資料進行統(tǒng)計學分析及圖表的繪制，組間比較用t檢驗及方差分析，p＜0.05時認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　一、溫熱干預(yù)下角質(zhì)形成細胞差異表達的熱休克蛋白及其時相性變化
　　1、44℃溫熱處理后，HSPA6、HSP90在mRNA水平迅速升高
　　角質(zhì)形成細胞經(jīng)溫熱處理后，HSPA6、HSP90的表達量

8、逐漸升高。與溫熱后即刻相比，HSPA6從2小時起開始出現(xiàn)差異性高表達，4小時后表達量達到最高并開始降低;HSP90在4小時出現(xiàn)差異性高表達，隨后達到最高并開始降低。
　　2、通過PCR Array的方法發(fā)現(xiàn)8個HSPs出現(xiàn)差異性高表達
　　從80余種熱休克蛋白中篩選發(fā)現(xiàn):溫熱后，DNAJA4、DNAJB1、CRYAB、BAG3、HSPA6、HSPA1A、HSPA1B及HSPA1L在角質(zhì)形成細胞中發(fā)生8倍以上的高表達;12個基

9、因出現(xiàn)2-6倍的上調(diào);余下基因的變化在0.5-2倍之間。
　　3、溫熱使角質(zhì)形成細胞的DNAJA4在蛋白水平上表達增高
　　溫熱后2小時，HaCaT細胞系中DNAJA4基因在蛋白水平上表達開始增高。
　　二、構(gòu)建DNAJA4基因敲除角質(zhì)形成細胞
　　以慢病毒為載體，分別轉(zhuǎn)入Cas9及gRNA基因，經(jīng)多種方法驗證:熒光顯微鏡觀察及流式細胞術(shù)顯示90％以上慢病毒載體成功轉(zhuǎn)入HaCaT細胞中;并且在基因及蛋白水平上成功

10、敲除DNAJA4基因。
　　三、DNAJA4基因影響角質(zhì)形成細胞中NF-κB通路的IL-1β途徑多個分子表達水平
　　1、基因表達譜差異分析結(jié)果
　　基因表達譜差異分析方法共鑒定22017種基因，溫熱后培養(yǎng)2小時及18小時的細胞中，DNAJA4的敲除分別僅引起7個及10個基因發(fā)生差異性變化;培養(yǎng)36小時的細胞中，DNAJA4的敲除可引起50個基因表達下降，45個基因表達增高。經(jīng)生物信息學分析提示，IL-1β參與其中多條

11、通路，與感染性疾病密切相關(guān)，值得進一步深入研究。
　　2、DNAJA4基因敲除后，NF-κB通路中多個基因表達降低
　　對比溫熱處理36小時后空載體及基因敲除細胞發(fā)現(xiàn): DNAJA4基因敲除后，IL-1β、IL-1R1、IRAK1、NFKBIA、P50及P65在RNA水平均表達下降，降低幅度為0.3-0.5倍;P65的S276位點磷酸化蛋白表達下降。
　　3、DNAJA4基因敲除后，細胞周期中G1期比例降低，G2/M期

12、比例增高
　　對比溫熱處理后培養(yǎng)36小時的空載體及基因敲除細胞發(fā)現(xiàn):DNAJA4基因敲除后，DNAJA4基因敲除細胞的S、G2期比率升高約5個百分點。
　　結(jié)論：
　　1、溫熱處理角質(zhì)形成細胞系HaCaT細胞后，DNAJA4、HSPA6及HSP90等8個熱休克蛋白發(fā)生8倍以上的高表達;12個基因出現(xiàn)2-6倍的上調(diào)，其余熱休克蛋白未發(fā)生顯著性變化。
　　2、DNAJA4基因敲除后，NF-κB通路的IL-1β途徑中多