Wnt-β-catenin信號(hào)通路對(duì)豬肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化影響的初步研究.pdf

1、骨骼肌組織中的成肌細(xì)胞是以肌衛(wèi)星細(xì)胞的形式而存在，是肌肉組織的前體細(xì)胞，在骨骼肌的生長(zhǎng)、發(fā)育、損傷及移植中具有重要作用。研究如何有效控制肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化，使骨骼肌朝著良性發(fā)展具有很重要的實(shí)踐意義。Wnt蛋白是一種由Wnt基因編碼的分泌型蛋白，通過(guò)自分泌或旁分泌作用與位于細(xì)胞膜上的受體相結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，調(diào)控胚胎的早期發(fā)育，而且與細(xì)胞極性建立、細(xì)胞命運(yùn)決定等多個(gè)發(fā)育事件有關(guān)。此外，它在高等動(dòng)物的胚胎發(fā)育過(guò)程中主要

2、參與細(xì)胞的增殖、分化、極化、凋亡與抗凋亡等。Wnt信號(hào)在胚胎發(fā)生中肌肉形成過(guò)程中是必要的，是肌細(xì)胞終末分化和衛(wèi)星細(xì)胞定向的關(guān)鍵調(diào)控因子。Wnt10b能特異性的調(diào)控肌細(xì)胞和再生肌肉的生脂潛能，并且激活Wnt10b可以抑制脂肪細(xì)胞分化。 本試驗(yàn)以初生健康長(zhǎng)白仔豬為試驗(yàn)動(dòng)物，采用RT-PCR技術(shù)成功克隆豬Wnt10b基因與Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵因子TCF4；分離培養(yǎng)骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞，Wnt/β-eatenin信號(hào)通路激

3、活劑25mM LiCl處理，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色、HE染色、半定量RT-PCR和Western Blot等方法，研究Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的影響，并對(duì)其機(jī)理進(jìn)行初步探討。主要獲得以下研究結(jié)果： 1.克隆了豬Wnt10b基因部分CDS序列1190bp，包含起始密碼子ATG。向GenBank提交，獲得登錄號(hào)EU181371，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)與GenBank上已公布的人、小鼠、

4、大鼠、牛、馬和黑猩猩核苷酸的同源性分別為94％、89％、89％、92％、93％和92％；氨基酸同源性分別為98％、96％、96％、94％、98％和97％。表明該基因在不同物種間具有很高的保守性。該段基因編碼394個(gè)氨基酸，具有Wnt家族保守的WNT1功能結(jié)構(gòu)域和糖基化位點(diǎn)。 2.RT-PCR檢測(cè)Wnt10b在豬不同組織中的表達(dá)差異，結(jié)果表明該基因在豬肝臟中表達(dá)量最高，心臟、肌肉組織、皮下脂肪以及脾臟中也表達(dá)。 3.成功克

5、隆Wnt/β-catenin通路關(guān)鍵因子TCF4基因全長(zhǎng)CDS序列2015bp，提交OenBank獲得登錄號(hào)EU694100。與GenBank上已公布的人、小鼠、大鼠、獼猴、牛和馬的TCF4基因進(jìn)行比對(duì)，同源性依次為94％、90％、89％、93％、93％和95％。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)開(kāi)放式閱讀框位于1-1281位。 4.25mM Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活劑LiCl處理豬骨胳肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞的成肌分化，而且