多靶點抗腫瘤天然活性成分篩選及其抑瘤活性研究.pdf

1、本論文重點圍繞多靶點抗腫瘤天然活性成分的篩選及抗腫瘤機制開展研究，構(gòu)建EGFR、TNFR、Fas多靶點脂筏色譜模型，提取北葶藶子中具有抗腫瘤活性的部位。研究抗腫瘤活性部位體外抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞株增殖、促進(jìn)凋亡、調(diào)控周期及抑制遷移的機理。分析北葶藶子抗腫瘤活性部位體內(nèi)的急性毒性，同時探討其體內(nèi)抑制乳腺癌MCF-7裸鼠移植瘤生長的機理。主要分為以下五個部分:
　　第一章多靶點脂筏親和色譜概述及中藥抗腫瘤概述
　　對脂筏親和

2、色譜的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，充分調(diào)研了脂筏親和色譜的研究現(xiàn)狀，闡述了多靶點脂筏親和色譜的構(gòu)建原理;分別基于中醫(yī)傳統(tǒng)理論及現(xiàn)代分子生物學(xué)角度對中藥抗腫瘤機制進(jìn)行了綜述。同時，闡述了本文研究對象，即北葶藶子的研究現(xiàn)狀，提出了本論文的研究目的、研究展望及實驗方案的設(shè)計，為論文實驗工作的順利進(jìn)行奠定了理論基礎(chǔ)。
　　第二章多靶點脂筏色譜的構(gòu)建及北葶藶子抗腫瘤活性部位的篩選
　　構(gòu)建了富含表皮生長因子受體(EGFR)、腫瘤壞死因子受體(

3、TNFR)和凋亡相關(guān)蛋白因子(Fas)的新型多靶點脂筏色譜，為實現(xiàn)多靶點、快速、在線篩選中藥抗腫瘤活性成分奠定了基礎(chǔ)。將多靶點脂筏色譜技術(shù)應(yīng)用于北葶藶子各部位抗腫瘤活性的篩選，采用MTT法對北葶藶子水飽和正丁醇萃取部位進(jìn)行抗腫瘤活性研究。
　　從人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株提取富含EGFR、TNFR、Fas的脂筏，制備硅膠固定相并與脂筏連接，構(gòu)建多靶點脂筏色譜。制備CdTe量子點并與EGFR、TNFR和Fas一抗偶聯(lián)后對脂筏色譜進(jìn)行鑒

4、定。采用多靶點脂筏色譜篩選北葶藶子的水提液、乙醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、水飽和正丁醇萃取部位及萃余部分的抗腫瘤活性部位。該活性部位以0.05μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL分別作用于人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、人肝癌細(xì)胞株HepG-2、人胃癌細(xì)胞株SGC和小細(xì)胞肺癌SCLC細(xì)胞株，72h后MTT法檢測其對四種腫瘤細(xì)胞生長的作用。此外，該活性部位及5-Fu分別以濃度1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、25

5、μg/mL、50μg/mL作用于大鼠成纖維細(xì)胞，MTT法考察該活性部位及5-Fu對大鼠成纖維細(xì)胞的毒性。結(jié)果表明:北葶藶子水飽和正丁醇萃取部位7.02～18.66 min在多靶點脂筏色譜柱上有保留行為，表明該部位具有抗腫瘤活性。MTT法檢測水飽和正丁醇萃取部位對MCF-7細(xì)胞株的抑制效果（IC50為0.77μg/mL）優(yōu)于HepG2（IC50為1.55μg/mL）、SGC（IC50為5.49μg/mL）和SCLC（IC50為6.09μg

6、/mL）細(xì)胞株。水飽和正丁醇萃取部位對大鼠成纖維細(xì)胞的毒性較小。
　　第三章北葶藶子活性部位抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株機制的研究
　　從抑制增殖、促進(jìn)凋亡、調(diào)控周期、抑制遷移四個方面對北葶藶子活性部位的體外抗腫瘤機制進(jìn)行了系統(tǒng)全面的研究。Western blot及免疫熒光法檢測了增殖相關(guān)的ERK磷酸化活性、凋亡相關(guān)的Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)、細(xì)胞周期蛋白PCNA的表達(dá);采用流式細(xì)胞技術(shù)對MCF-7細(xì)胞株的早期凋亡和周期

7、進(jìn)行了分析;采用DNA Ladder和transwell技術(shù)研究了MCF-7細(xì)胞株的凋亡及其遷移。
　　Western blot及免疫熒光法檢測了北葶藶子活性部位對ERK磷酸化活性的作用，結(jié)果表明:其明顯抑制了ERK磷酸化的活性，且隨濃度的增加，抑制作用明顯增強。由此推測，北葶藶子活性部位對MCF-7細(xì)胞株的抑制增殖作用是通過抑制ERK介導(dǎo)的MAPK信號通路而實現(xiàn)的。
　　通過Western blot檢測了北葶藶子活性部位對

8、Bcl-2和Bax蛋白的作用，結(jié)果表明:北葶藶子活性部位作用于MCF-7細(xì)胞株24h后，對Bcl-2表達(dá)的抑制作用和對Bax表達(dá)的促進(jìn)作用均呈現(xiàn)出劑量依賴性，說明其在24h時促進(jìn)MCF-7細(xì)胞株凋亡是通過調(diào)控Bcl-2家族的表達(dá)來實現(xiàn)的。AnnexinⅤ/PI雙染檢測細(xì)胞早期凋亡發(fā)現(xiàn)，北葶藶子活性部位可以明顯增加MCF-7細(xì)胞株的早期凋亡，且具有時間劑量依賴關(guān)系。DNA Ladder研究北葶藶子活性部位及5-Fu對MCF-7細(xì)胞株凋亡的

9、作用，結(jié)果表明:活性部位及5-Fu作用72h后，低、中、高三個濃度均可看到明顯的梯形條帶。
　　流式細(xì)胞技術(shù)分析北葶藶子活性部位對MCF-7細(xì)胞株周期影響的結(jié)果顯示，空白對照組S期細(xì)胞所占比例較高，提示MCF-7細(xì)胞株DNA合成活躍，腫瘤增殖性強。北葶藶子活性部位高濃度使MCF-7細(xì)胞株G0/G1期細(xì)胞的比例明顯增加，而S期MCF-7細(xì)胞所占的比例明顯下降，且有劑量依賴關(guān)系，表明其將MCF-7細(xì)胞株阻滯于G0/G1期，造成了G1期

10、細(xì)胞堆積阻滯。Western blot及免疫熒光法分析PCNA蛋白的表達(dá)，北葶藶子活性部位的低濃度給藥組在不同時間點均對PCNA的表達(dá)無明顯抑制作用，而中、高濃度組則能明顯抑制PCNA的表達(dá)，從而干擾MCF-7細(xì)胞S期DNA的合成，降低了S期細(xì)胞所占比例。
　　采用transwell法檢測了北葶藶子活性部位及5-Fu對MCF-7細(xì)胞株遷移的作用。結(jié)果表明:北葶藶子活性部位組及5-Fu組均能明顯抑制MCF-7細(xì)胞株的遷移，且均呈時間

11、劑量依賴關(guān)系。相同濃度的北葶藶子活性部位組與5-Fu組兩者對細(xì)胞遷移的抑制作用無明顯差異。
　　第四章北葶藶子活性部位急性毒理學(xué)研究
　　采用急性毒性分類法、改良寇氏法評價北葶藶子活性部位經(jīng)口、經(jīng)腹腔急性毒性作用。計算了北葶藶子活性部位經(jīng)口/腹腔的LD50，為其裸鼠移植瘤抑制作用的研究提供了劑量依據(jù);通過計算北葶藶子活性部位經(jīng)口/腹腔的臟器系數(shù)，評價其急性毒性。
　　急性毒性分類法結(jié)果表明:北葶藶子活性部位按2000

12、mg/kg的劑量對小鼠灌胃給藥的LD50約為4000～5000mg/kg，為低毒物質(zhì)。改良寇氏法計算腹腔注射給藥的LD50，結(jié)果顯示:小鼠腹腔注射給藥的LD50為505.36 mg/kg，LD50的95％平均可信限為590.32 mg/kg～432.61 mg/kg。北葶藶子活性部位腹腔注射劑量低于250mg/kg時，無急性毒性，為低毒物質(zhì)。
　　第五章北葶藶子活性部位對裸鼠MCF-7移植瘤抑制作用的研究
　　構(gòu)建了人乳腺癌

13、MCF-7細(xì)胞株裸鼠移植瘤模型，對北葶藶子活性部位經(jīng)口、經(jīng)腹腔的體內(nèi)抑瘤活性進(jìn)行了評價。采用Western blot檢測了Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，對北葶藶子活性部位的體內(nèi)抗腫瘤機制進(jìn)行了初步探討。
　　裸鼠背部右側(cè)皮下接種MCF-7細(xì)胞株建立移植瘤模型，北葶藶子活性部位按100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg口服給藥;按25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg腹腔注射給藥;5-Fu腹腔注射給

14、藥20 mg/kg，治療4周。治療結(jié)束后剝離瘤塊，測量瘤塊體積并稱重。采用Western blot對Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果表明:北葶藶子活性部位經(jīng)口服給藥、腹腔注射給藥及5-Fu對瘤塊體積和重量均有明顯抑制作用(P＜0.05)。Western blot檢測北葶藶子活性部位組及5-Fu組均明顯降低了Bcl-2蛋白的表達(dá)，增加了Bax蛋白的表達(dá)(P＜0.05)。北葶藶子活性部位腹腔注射給藥組對Bcl-2的抑制作用有劑量依