硫化氫在腦血管內(nèi)皮舒張功能中的作用及杜鵑花總黃酮抗缺血性腦損傷作用機(jī)制.pdf

1、硫化氫（hydrogen sulfide,H2S）是繼一氧化氮、一氧化碳之后發(fā)現(xiàn)的第三種新的氣體信號(hào)分子。在多物種、不同類型的外周血管上，H2S的血管舒張作用都得到了證實(shí)，但未見H2S對(duì)腦血管作用的報(bào)道。腦血管內(nèi)皮損傷是腦缺血性疾病病理生理過程中的一個(gè)重要事件，H2S對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞有無保護(hù)作用及其機(jī)制尚不明確。杜鵑花總黃酮（total flavones ofrhododendra，TFR）有很好的抗缺血性腦損傷作用，但尚不明確其作用是

2、否與H2S有關(guān)。本研究試圖通過siRNA基因沉默技術(shù)及其它相關(guān)技術(shù)，觀察H2S對(duì)腦血管內(nèi)皮舒張反應(yīng)的影響及涉及的離子通道，并利用缺氧再給氧腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞模型，觀察H2S對(duì)腦血管內(nèi)皮的保護(hù)作用及其與SIRT6的關(guān)系。在CSE-siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染大鼠和CSE-KO小鼠模型，探討了TFR抗腦缺血再灌注損傷作用與H2S的關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　1.觀察H2S對(duì)腦血管內(nèi)皮舒張作用的影響及涉及的離子通道；
　　2.觀察H2S

3、對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧再給氧損傷的保護(hù)作用及其與SIRT6的關(guān)系；
　　3.觀察TFR的抗腦缺血性損傷作用及其與H2S的關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.建立大鼠CSE-siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染模型，q-PCR法檢測血管CSE-mRNA的表達(dá)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測定血管H2S生成量。
　　2.采用離體血管張力實(shí)驗(yàn)，觀察ACh、H2S合成底物L(fēng)-Cys及TFR對(duì)大鼠腦血管的舒張作用，同時(shí)觀察去內(nèi)皮及PPG（CSE抑制劑）對(duì)其舒張作

4、用的影響；觀察外源性H2S供體NaHS對(duì)大鼠腦血管的舒張作用，同時(shí)觀察Apamin（SKCa通道阻滯劑）、ChTx（IKCa通道阻滯劑）、Iberiotoxin（BKCa通道阻滯劑）及Glibenclamide（KATP通道阻滯劑）對(duì)NaHS血管舒張反應(yīng)的影響。
　　3.采用離體血管張力測定實(shí)驗(yàn)，觀察ACh、L-Cys及TFR在CSE-siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染大鼠腦血管舒張作用的變化；觀察 TFR在 CSE-KO小鼠基底動(dòng)脈和主動(dòng)脈舒張

5、作用的變化。
　　4.建立局灶性大鼠腦缺血再灌注損傷（I/R）模型，觀察TFR對(duì)CSE-siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積百分比及腦血管H2S生成的影響。
　　5.建立局灶性小鼠腦缺血再灌注損傷模型，觀察 TFR對(duì) CSE-KO小鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積百分比及腦血管H2S生成的影響。
　　6.建立bEnd.3細(xì)胞缺氧再給氧（OGD/R）模型，通過細(xì)胞生成率檢測和LDH、SOD、CAT及ROS測定，驗(yàn)證H

6、2S對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用；測定OGD/R細(xì)胞SIRT6的表達(dá)，觀察H2S及TFR對(duì)OGD/R細(xì)胞SIRT6表達(dá)的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.CSE-siRNA大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染48h后，與Sham組、陰性對(duì)照組及轉(zhuǎn)染試劑組相比較，CSE-mRNA的表達(dá)明顯降低，同時(shí)腦血管及主動(dòng)脈H2S生成量也明顯降低。
　　2.血管張力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ACh（10-8~10-5.5 mol/L）對(duì)大鼠基底動(dòng)脈（BA）和大腦中動(dòng)脈（MCA）有濃

7、度依賴性的舒張作用，其最大舒張率（Emax）分別是72.88±5.02％和69.84±7.45%；加用CSE酶抑制劑PPG后，Emax明顯下降；內(nèi)皮去除后，ACh誘導(dǎo)的舒張作用消失。
　　3.血管張力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，L-Cys（10-5~10-2.5mol/L）可濃度依賴性地舒張大鼠BA和MCA，其Emax分別是77.15±6.15%和80.37±5.36%；加用PPG和去除內(nèi)皮后，Emax均明顯下降。
　　4.血管張力實(shí)驗(yàn)結(jié)

8、果顯示，NaHS（10-5~10-2.5mol/L）可濃度依賴性地舒張大鼠BA和MCA，其Emax分別是86.45±6.12%和89.72±6.53%；去除內(nèi)皮對(duì)NaHS的舒張作用無明顯影響。加用Apamin（SKCa阻滯劑）、ChTx（IKCa阻滯劑）及Glibenclamide（KATP阻滯劑），Emax分別有不同程度地下降；加用Iberiotoxin（BKCa阻滯劑）后，Emax未見明顯下降。
　　5.血管張力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，

9、ACh對(duì)CSE-siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染大鼠BA、MCA及主動(dòng)脈的濃度依賴性舒張作用減弱；L-Cys對(duì)CSE-siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染大鼠BA和MCA的濃度依賴性舒張作用也同樣減弱。
　　6.缺氧再給氧（OGD/R）可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞生存率降低；NaHS預(yù)處理（25~100uM）能夠濃度依耐性地減輕OGD/R誘發(fā)的細(xì)胞死亡和乳酸脫氫酶（LDH）的升高；PPG預(yù)處理則加重OGD/R誘發(fā)的細(xì)胞死亡和LDH的升高。
　　7.OGD/R可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)

10、胞超氧化歧化酶（SOD）及過氧化氫酶（CAT）降低，活性氧（ROS）增高；NaHS預(yù)處理（50uM）能夠改善 OGD/R誘發(fā)的 SOD和CAT降低及ROS升高；PPG預(yù)處理則加重OGD/R誘發(fā)的SOD和CAT降低及ROS升高。
　　8.OGD/R可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞SIRT6表達(dá)下調(diào)，NaHS（50uM）及TFR（900mg/L）預(yù)處理可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞SIRT6的表達(dá)。
　　9.血管張力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TFR（11~2700 mg/L

11、）可濃度依賴性地舒張大鼠BA和MCA，其Emax分別是65.76±5.84%和67.09±4.93%；加用PPG后，Emax明顯下降；TFR對(duì)CSE-siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染大鼠BA和MCA的濃度依賴性舒張作用同樣減弱；TFR對(duì)CSE-KO小鼠BA和主動(dòng)脈的舒張作用消失。
　　10.TFR預(yù)孵可增加大鼠腦血管H2S生成量；PPG可抑制TFR的上述作用。
　　11.腦缺血再灌注（I/R）可導(dǎo)致大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死體積百分比增加，

12、腦血管H2S生成量降低，TFR預(yù)處理可改善I/R誘發(fā)的上述變化；在CSE-siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染大鼠，TFR預(yù)處理改善I/R誘發(fā)的神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積百分比增加及腦血管H2S生成量降低的作用減弱。
　　12.I/R可導(dǎo)致小鼠神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死體積百分比增加，腦血管H2S生成量降低，TFR預(yù)處理可減輕I/R誘發(fā)的上述變化；在CSE-KO小鼠，I/R誘發(fā)的上述變化加重；在CSE-KO小鼠上，TFR預(yù)處理對(duì)I/R誘發(fā)的神經(jīng)功能評(píng)分、腦

13、梗死體積百分比增加及腦血管H2S生成量的降低無明顯影響。
　　結(jié)論：
　　1.內(nèi)源性H2S參與了ACh誘導(dǎo)的大鼠BA和MCA內(nèi)皮依賴性的舒張反應(yīng)；
　　2.外源性H2S可舒張大鼠BA和MCA，其作用涉及SKCa、IKCa和KATP通道；
　　3.外源性H2S對(duì)缺氧再給氧誘發(fā)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有保護(hù)作用，其作用可能與SIRT6的表達(dá)上調(diào)有關(guān)；
　　4. TFR可舒張大鼠BA和MCA，其作用可能與腦血管內(nèi)皮細(xì)