NE對(duì)離體腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血性損傷的作用.pdf

1、背景：缺血性腦血管疾病是人類死亡率最高的三大疾病之一，深入研究缺血性腦血管疾病的病理生理機(jī)制，尋找治療缺血性腦血管疾病的新靶點(diǎn)并開(kāi)發(fā)相應(yīng)的治療藥物，不僅具有重要的社會(huì)效益，也有顯著的經(jīng)濟(jì)效益。目前，關(guān)于腦缺血/再灌注損傷的病理生理機(jī)制研究主要集中在能量代謝障礙、氧自由基應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)游離鈣超載、興奮性氨基酸釋放過(guò)多、線粒體的損傷以及神經(jīng)元細(xì)胞凋亡程序啟動(dòng)等。近年來(lái)，炎癥反應(yīng)在腦缺血/再灌注中的作用逐漸引起人們的重視?，F(xiàn)已證實(shí)，中性粒細(xì)胞(

2、polymorphonuclear leukocyte，PMN)及炎癥細(xì)胞因子觸發(fā)的血管炎癥反應(yīng)在神經(jīng)元腦缺血/再灌注損傷中具有重要作用。中性粒細(xì)胞在腦缺血/再灌注損傷中的作用主要包括兩個(gè)方面：(1)機(jī)械性阻塞作用；(2)釋放炎癥介質(zhì)與蛋白水解酶(主要是彈性蛋白酶)，加重缺血腦組織損傷。 彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)是機(jī)體內(nèi)一種具有強(qiáng)烈水解活性的蛋白水解酶，最適底物為彈性蛋白。研究表明，NE不僅參與

3、了多種炎癥性疾病如慢性支氣管炎、支氣管擴(kuò)張癥、生殖道感染等疾病的發(fā)生發(fā)展，也在組織、器官的缺血/再灌注損傷中如急性肺損傷起著重國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30572074)要作用，抑制NE活性對(duì)這些組織、器官的缺血/再灌注損傷有顯著的保護(hù)作用。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞受損是腦血管疾病的早期病變和基本誘因。所以，通過(guò)研究NE及其特異抑制劑西維來(lái)司鈉在缺氧復(fù)氧過(guò)程中對(duì)于大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響，則可以進(jìn)一步證實(shí)NE參與了腦缺血/

4、再灌注損傷，NE抑制劑西維來(lái)司鈉(Sivelestat sodium，Siv)可能對(duì)腦缺血/再灌注損傷有保護(hù)作用。 目的：(1)進(jìn)一步探討大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法并對(duì)之進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。為建立離體血腦屏障提供基礎(chǔ)。(2)建立一種方便、穩(wěn)定、可靠的體外細(xì)胞氧糖剝奪(oxygenglucose deprivation，OGD)/復(fù)氧(reoxygenation)模型。(3)明確NE是否通過(guò)損傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞等機(jī)制加重缺血/再灌

5、注后的腦損傷，因而NE將成為腦血管疾病治療一個(gè)新的作用靶點(diǎn)，NE抑制劑西維來(lái)司鈉也將成為一種新型的神經(jīng)保護(hù)劑用于腦血管疾病的治療，這無(wú)疑將會(huì)產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。 方法：原代培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)倒置顯微鏡、免疫細(xì)胞化學(xué)、電鏡進(jìn)一步鑒定，采用MTT法測(cè)定生長(zhǎng)曲線，分離大鼠外周血中性粒細(xì)胞，建立體外氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖和中性粒細(xì)胞損傷模型。將實(shí)驗(yàn)分5組：正常對(duì)照組(NC組)、缺血/再灌注模型組(I/R組)；模型+中性

6、粒細(xì)胞損傷組(I/R+PMN組)；模型+中性粒細(xì)胞損傷+西維來(lái)司鈉組(UR+PMN+Siv組)，其中，可按西維來(lái)司鈉的不同濃度分為低、中、高三個(gè)劑量亞組；模型+中性粒細(xì)胞損傷+依達(dá)拉奉組(I/R+PMN+Eda組)。采用ELISA定量測(cè)定每組中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)的表達(dá)、MTT法和LDH測(cè)定每組細(xì)胞的存活率和損傷程度、放射免疫法測(cè)定每組細(xì)胞內(nèi)皮素-1(ET-1)的分泌量、細(xì)胞免疫化學(xué)定性檢測(cè)每組細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的

7、表達(dá)、RT-PCR半定量測(cè)定每組BMEC中血管生成素受體-2 mRNA(Tie-2 mRNA)的表達(dá)。 結(jié)果：(1)經(jīng)形態(tài)學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、電鏡鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞為大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。(2)離體BMEC經(jīng)氧糖剝奪4h/復(fù)氧復(fù)糖24h后可模擬腦缺血/再灌注損傷。(3)測(cè)定NE、MTT、LDH、ET-1、ICAM-1、Tie-2 mRNA均顯示：氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖過(guò)程能對(duì)BMEC造成損傷，I/R組與NC組比較有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<

8、0.05)；中性粒細(xì)胞能加重對(duì)BMEC的損傷，I/R組與I/R+PMN組之間比較亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)；西維來(lái)司鈉處理后，血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷明顯減輕，I/R+PMN組與I/R+PMN+SIR組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，并且NE測(cè)定以及MTT、LDH實(shí)驗(yàn)提示在西維來(lái)司鈉三個(gè)劑量組之間存在明顯的量．效關(guān)系，其對(duì)BMEC的保護(hù)作用有劑量依賴性。 結(jié)論：(1)成功的培養(yǎng)出了大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞，為建立離體血-腦屏障，研究腦