利用RNAi技術(shù)探討酸感受離子通道（ASICs）的特性.pdf

1、酸感受離子通道(acid-sensing ion channels，ASICs)是H<'+>門(mén)控的陽(yáng)離子通道，在胞外H<'+>濃度增高時(shí)激活開(kāi)放，胞外Na<'+>通過(guò)其開(kāi)放的通道進(jìn)入胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞去極化興奮。ASICs通道屬于表皮鈉通道/退化因子基因(ENaC/DEG，epithelialsodium channel/degenerin gene)超家族的一員，到目前為止，已克隆了由4個(gè)基因編碼的6個(gè)不同亞基，它們分別是：ASIC1a，

2、ASIC1b，ASIC2a，ASIC2b，ASIC3和ASIC4。其中，ASIC1a是一個(gè)很重要的亞基，它在突觸傳遞及其可塑性的調(diào)節(jié)、空間學(xué)習(xí)記憶、長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)、痛覺(jué)傳導(dǎo)和缺血性腦損傷等生理和病理活動(dòng)中起重要作用。組織酸化是一個(gè)很常見(jiàn)的病理現(xiàn)象，如腦卒中，癲癇發(fā)作，炎癥，腫瘤組織和代謝異常等都會(huì)引起局部組織的酸化進(jìn)而組織損傷。以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ASIC1a參與了酸化誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的過(guò)程，在電壓門(mén)控性Ca<'2+>通道和谷氨酸受體阻

3、斷劑存在的情況下，ASIC1a激活隨之胞內(nèi)Ca<'2+>超載能引起時(shí)間依賴(lài)的神經(jīng)損傷，并可被ASIC1a特異性阻斷劑(PcTX1)或降低胞外Ca<'2+>所抑制。為了進(jìn)一步探索抑制ASICs與酸化誘導(dǎo)損傷的關(guān)系，本研究采用了以ASIC1a基因?yàn)榘悬c(diǎn)的RNAi(RNA interference)技術(shù)，旨在觀察敲減ASIC1a亞基表達(dá)后可能的抗酸性神經(jīng)保護(hù)作用。 本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)RT-PCR法確證了ASICs各亞基在大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6

4、細(xì)胞，大鼠海馬神經(jīng)元和DRG神經(jīng)元中的表達(dá)。然后利用RNAi技術(shù)構(gòu)建了針對(duì)ASIC1a和ASIC2a亞基的shRNA表達(dá)載體，經(jīng)western blotting篩選出有效的干擾質(zhì)粒。隨后建立了穩(wěn)定敲減ASIC1a表達(dá)的細(xì)胞株和穩(wěn)定陰性對(duì)照細(xì)胞株，經(jīng)半定量RT-PCR和western blotting證實(shí)了穩(wěn)定株中ASIC1a的敲減效果。 通過(guò)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和測(cè)集落形成率的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：抑制ASIC1a亞基的表達(dá)未改變正常情況下細(xì)胞

5、的生長(zhǎng)增殖情況。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和LDH釋放實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在不同酸性條件下(pH6.0，pH6.5，pH6.9)抑制ASIC1a亞基的表達(dá)能顯著減輕酸化誘導(dǎo)的損傷反應(yīng)：細(xì)胞存活數(shù)目明顯增多，生存狀態(tài)也有所改善。LDH釋放實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在大鼠海馬神經(jīng)元上轉(zhuǎn)染pshRNA1a2干擾質(zhì)粒抑制ASIC1a亞基表達(dá)后，能顯著減輕pH6.0酸性條件下神經(jīng)元的損傷，這與C6細(xì)胞上得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。 為了探索ASIC1a亞基的敲減是否是細(xì)胞抗酸性損傷的主

6、要原因，在實(shí)驗(yàn)中我們對(duì)比了加入氨氯吡咪(amiloride)與抑制ASIC1a亞基表達(dá)對(duì)pH6.0損傷保護(hù)作用的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：它們的保護(hù)作用相當(dāng)，差異無(wú)顯著性意義。為了初探C6細(xì)胞上抑制ASIC1a亞基表達(dá)抗酸性損傷的機(jī)制，首先證明了C6細(xì)胞上有可通透Ca<'2+>的被酸激活的通道，然后比較了在pH6.0條件下胞外Ca<'2+>從0.2mM上升到1.3mM時(shí)對(duì)shRNA1a2(2)和shNEG細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，酸化能引起兩組細(xì)胞的