人造特異性RNA內(nèi)切酶治療1型強直性肌營養(yǎng)不良癥及優(yōu)化PUF結(jié)構域的初步研究.pdf

1、1型強直性肌營養(yǎng)不良癥（Myotonic dystrophy type1，DM1）是一種常染色體顯性遺傳病，其癥狀包括肌強直、肌肉萎縮、心臟傳導缺陷、胰島素耐受、白內(nèi)障和認知缺陷等。DM1是最常見的成人肌營養(yǎng)不良癥，全球發(fā)病率大概是1/8000。DM1是由于位于19q13.3染色體上的強直性肌營養(yǎng)不良蛋白激酶（myotonic dystrophy protein kinase，DMPK）基因3'端非翻譯區(qū)的CTG重復序列異常擴增所致。D

2、M1的發(fā)病機制尚不完全清楚，目前普遍認為是DMPK的mRNA發(fā)生了功能獲得性突變，即異常擴增的CTG轉(zhuǎn)錄成有毒性的CUG RNA重復序列，并與一些轉(zhuǎn)錄因子和可變剪接調(diào)控因子等結(jié)合，形成核內(nèi)聚集體(foci)，滯留在細胞核內(nèi)，從而破壞基因的正常表達和可變剪接。目前研究最清楚的兩類受CUG重復序列影響的剪接調(diào)控因子:Muscleblind樣蛋白家族和CUG-BP,Elav-like蛋白家族，它們的異常表達造成許多下游目的基因的可變剪接發(fā)生異

3、常。雖然通過反義寡核苷酸和RNAi等方法，DM1的癥狀可以得到一定的緩解，但到目前為止還不能完全治愈。
　　本文研究了一種利用人造特異性RNA內(nèi)切酶（artificial site-specific RNAendonucleases，ASREs）治療DM1的新方法。首先，通過重新編碼得到特異性識別CUG重復序列的PUF結(jié)構域，并通過酵母三雜交系統(tǒng)和凝膠遷移實驗進行驗證;其次，通過將重新編碼的PUF結(jié)構域與PIN結(jié)構域（RNA內(nèi)切酶

4、結(jié)構域）融合得到ASREs，其能夠在培養(yǎng)細胞中特異性降解異常擴增的CUG重復序列;再次，ASREs的表達能夠顯著性減少DM1病人細胞中核內(nèi)聚集體的數(shù)量;此外，ASREs的表達能夠有效地逆轉(zhuǎn)DM1病人細胞中IR、BIN1、cTNT、Nfix、SMYD1和SERCA1基因的異常剪接。總之，ASREs為DM1治療提供了一種新的基因治療策略。ASREs在DM1病人細胞中的應用取得了令人滿意的效果，然而由于天然PUF結(jié)構域含有8個重復序列，即只能

5、識別8個連續(xù)的RNA堿基，導致ASRE識別靶標序列的特異性有限，可能存在脫靶的現(xiàn)象，因此我們進一步研究并優(yōu)化PUF結(jié)構域的RNA結(jié)合特性。首先，通過增加重復序列的數(shù)量來提高PUF結(jié)構域的結(jié)合特性，隨著重復序列數(shù)目的增加，PUF結(jié)構域激活下游報告基因的能力也隨之增強，當重復序列數(shù)目達到9時，LacZ活性達到頂峰;其次，通過改良PUF結(jié)構域，得到了結(jié)合RNA能力更強的PUF結(jié)構域。通過對PUF結(jié)構域結(jié)合特性的改造和優(yōu)化，將為模塊化的PUF結(jié)